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第一部分USP49在非小细胞肺癌中的表达研究目的:去泛素化酶与肿瘤的发生发展密切相关,并且研究认为,靶向去泛素化酶开发相应抗肿瘤靶向药物已成为一种有效的策略。我们前期通过公共癌症数据库GEPIA分析发现,去泛素化酶USP49在非小细胞肺癌（NSCLC）中低表达,但其功能及其分子机制目前尚无文献报道。因此,本部分基于前期发现,将分析去泛素化酶USP49在NSCLC肿瘤组织及细胞系中的表达情况,并考察其表达高低与NSCLC病人预后的关系,从而更好地了解去泛素化酶USP49在NSCLC中的相关功能及作用机制,为临床上开发以USP49为靶点的靶向药物奠定一定的理论基础。方法:（1）运用GEPIA大数据库对USP49进行分析,分析对象为肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）,分析结果为对比正常组织中的USP49的表达情况;（2）通过qRT-PCR的方法检测了 20例NSCLC病人样本中肿瘤组织以及癌旁组织中USP49的mRNA表达水平;（3）利用蛋白免疫印迹技术检测了 4株NSCLC细胞以及1株人支气管上皮样细胞中USP49的表达水平;（4）运用Kaplan-Meierplotter分析了肺癌患者表达不同水平USP49后,对其生存率的影响情况。结果:（1）从GEPIA数据库中分析可以看到,USP49在肺腺癌和肺鳞状细胞癌病人中的表达水平要明显低于正常组织中的表达水平;（2）采用qRT-PCR对20例NSCLC病人中肿瘤组织和癌旁组织中USP49的mRNA表达水平进行了分析,发现与癌旁组织比,USP49在NSCLC肿瘤组织中显著性低表达;（3）采用qRT-PCR以及蛋白免疫印迹法对细胞系中USP49的表达进行分析,发现相比较正常支气管上皮样细胞,USP49的mRNA及蛋白水平在NSCLC细胞系中都显著性低表达;（4）从Kaplan-Meier plotter分析的数据显示,肺癌中USP49的高表达可以明显延长病人的总生存率。结论:USP49在NSCLC中低表达,无论是通过对肿瘤数据库GEPIA、Kaplan-Meier plotter的分析,还是对病人原代组织、不同的NSCLC细胞系中USP49的检测,都可以得到证实。以上这些数据表明,USP49可能与NSCLC的发生发展密切相关。另外,Kaplan-Meier plotter分析发现,高表达USP49的肺癌患者,其整体存活率显著高于低表达的患者,这提示USP49还可以作为临床肺癌病人预后的一个重要评价指标。第二部分USP49通过阻断细胞周期抑制非小细胞肺癌的生长目的:既然USP49在肺癌中尤其是非小细胞肺癌（NSCLC）中低表达,为了进一步了解去泛素化酶USP49在NSCLC中的功能及其分子机制,本部分通过利用慢病毒过表达系统分析了过表达USP49在NSCLC中的作用,从而阐述去泛素化酶USP49在肺癌中的相关功能及其作用机制。方法:（1）利用慢病毒过表达系统在NSCLC细胞中过表达USP49基因;（2）利用CCK-8检测过表达USP49对NSCLC细胞生长的影响;（3）利用蛋白免疫印迹法检测过表达USP49对细胞周期相关蛋白的影响;（4）利用流式细胞技术检测过表达USP49对NSCLC细胞周期的影响。结果:（1）过表达USP49能够明显抑制NSCLC细胞的生长;（2）通过蛋白免疫印迹法检测发现,在NSCLC细胞中过表达USP49可以明显抑制细胞周期蛋白CyclinD1的表达以及诱导p53蛋白的表达;（3）利用流式细胞技术进一步分析发现,在NSCLC细胞中过表达USP49能够有效阻止细胞周期从G0期向G1期的转化。结论:在NSCLC细胞中,过表达USP49可以明显抑制细胞的生长。进一步通过流式细胞技术分析发现,过表达USP49能够有效抑制细胞周期从GO期向G1期的转化,从而抑制NSCLC细胞生长。接着,对其下游信号通路蛋白检测发现,USP49的过表达能够显著抑制细胞周期蛋白Cyclin D1的表达,以及上调抑癌蛋白p53的表达。第三部分USP49调控非小细胞肺癌中PI3K/AKT信号通路目的:PI3K信号通路与肿瘤细胞的生长、增殖、迁移都密切相关。我们前期研究发现,USP49能够影响非小细胞肺癌（NSCLC）中PI3K信号通路。为了进一步验证这一现象,以及为了研究去泛素化酶USP49在NSCLC中的具体作用机制,本部分通过过表达和沉默USP49来检测对PI3K信号通路一系列相关蛋白的表达水平的影响,从而更加明确地阐述去泛素化酶USP49在NSCLC中的作用机制。方法:（1）通过蛋白免疫印迹法检测NSCLC中过表达USP49对PI3K信号通路中的调节亚基p85的磷酸化的影响;（2）通过蛋白免疫印迹法检测NSCLC中过表达USP49对PI3K信号通路中AKT蛋白的磷酸化,以及PI3K信号通路下游蛋白mTOR的磷酸化水平的影响;（3）利用shRNA干扰技术检测沉默USP49对PI3K p85磷酸化的影响;（4）利用shRNA干扰技术检测沉默USP49对AKT以及mTOR的磷酸化水平的影响。结果:（1）在NSCLC中过表达USP49,可以明显抑制PI3K的调节亚基p85的磷酸化水平;（2）在NSCLC中过表达USP49,明显抑制了 PI3K信号通路中AKT蛋白的磷酸化,以及PI3K信号通路下游蛋白mTOR的磷酸化;（3）利用shRNA沉默USP49能够上调PI3K p85的磷酸化水平;（4）利用shRNA沉默USP49同时也上调AKT蛋白的磷酸化,以及上调mTOR的磷酸化水平。结论:在NSCLC细胞中,过表达USP49能够显著抑制PI3K p85、AKT和mTOR的磷酸化水平,而沉默USP49后,能够显著上调PI3K p85、AKT和mTOR的磷酸化。这些提示,去泛素化酶USP49可以通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路来影响NSCLC的生长。第四部分USP49通过抑制PTEN蛋白的多聚泛素化来稳定PTEN目的:在PI3K/AKT信号通路中,PTEN是其主要的负调控因子。而上一部分研究发现,过表达USP49能够有效抑制PI3K/AKT信号通路。因此,本部分将探索USP49是否通过影响PTEN的表达来影响PI3K/AKT信号通路。并将进一步探索USP49作为去泛素化酶,是否可以直接影响PTEN的泛素化水平,从而更深一步地阐述USP49在NSCLC中的作用机制。方法:（1）运用GEPIA大数据库对USP49和PTEN的表达情况进行相关性分析;（2）通过蛋白免疫共沉淀分析USP49能否影响USP49的多聚泛素化;（3）通过质粒过表达及shRNA法研究过表达或干扰USP49是否影响PTEN的表达水平;（4）CHX chase实验考察USP49对PTEN蛋白半衰期的影响。结果:（1）GEPIA数据库分析发现,USP49和PTEN的表达存在一定的相关性;（2）通过蛋白免疫共沉淀实验发现,USP49能够显著降低PTEN蛋白的多聚泛素化;（3）通过质粒过表达及shRNA沉默USP49发现,过表达或沉默USP49能够影响PTEN的蛋白表达,而对其mRNA水平并无显著影响;（4）通过CHX chase实验发现,USP49能够延长PTEN蛋白的半衰期。小结:在NSCLC中,USP49可以直接通过调控PTEN蛋白的去泛素化来稳定PTEN蛋白的表达水平,这一机制可以丰富去泛素化酶USP49在NSCLC中的泛素化机制。