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背景与目的：
多环芳香烃(PAHs)是一种常见的环境污染物,具有致突变、致癌变和致畸的毒性,是常见的环境致癌剂。苯并[a]芘(benzo[a]pyrene,B[a]P)是PAHs的代表性物质,是常见于烟草、汽车尾气、工厂煤烟、煤焦油中的强前致癌物,人类长期接触B[a]P将增加罹患肺癌等恶性肿瘤的风险。反式-7,8-二氢二醇-9,10-环氧苯并(a)芘(anti-benzo[a]pyrene-trans-7,8-diol-9,10-epoxide,anti-BPDE)是B[a]P的重要代谢产物,是终致癌物。
microRNA(miRNA)是长度约22个寡核苷酸的非编码小RNA分子,由初始转录本(pri-miRNA)和前体(pre-miRNA)剪切而来。miRNA的表达水平具有组织特异性和时空特异性,miRNA广泛参与调控细胞发育、分化和凋亡等一系列重要的生命过程。miRNA以碱基配对的方式识别并结合于靶基因mRNA3端非翻译区,抑制蛋白质翻译或降解mRNA,在转录后水平调控基因的表达。脊椎动物miRNA至少调节基因组中约30％的基因,miRNA的异常表达与疾病发生及各种癌症的病理进程紧密相关。
本研究检测终浓度2.0μmol/L anti-BPDE恶性转化的16HBE细胞(16HBE-T)与非转化对照细胞(16HBE-N)miRNA表达谱,筛选差异表达miRNA,寻找与细胞恶性转化潜在相关的miRNA。同时运用生物信息学方法,寻找选定的一个miRNA-miR-10a作用的候选靶位点,并探讨miR-10a与同源盒Al(homeobox Al.HOXA1)的相关关系。
方法：
1.运用高通量的miRNA微阵列技术分析anti-BPDE恶性转化细胞16HBE-T与非转化对照组细胞16HBE-N miRNA表达谱。
(1)培养anti-BPDE恶性转化16HBE-T和溶剂对照16HBE-N第30代细胞至对数生长期,抽提RNA。
(2)对miRNA进行荧光标记、浓缩,与miRNA微阵列水浴杂交。
(3)用Genepix 4000B对原始杂交图像进行扫描,用Genepix Pro 6.0软件分析信号强度,以EXCEL格式输出结果。
2.选择差异表达明显的miR-10a和miR-320,运用miRNA逆转录定量PCR(miR-qRT-PCR)验证微阵列数据。
(1)抽提16HBE-T和16HBE-N细胞总RNA,分别用miR-10a和miR-320茎-环结构逆转录引物进行逆转录。
(2)分别用miR-10a和miR-320逆转录产物进行定量PCR。
3.利用生物信息学方法分析HOXA13UTR保守序列和miR-10a的种子序列,发现HOXA1 3UTR存在与miR-10a种子序列配对的保守序列,是miR-10a的潜在作用靶位点。
4.HOXA1表达水平分析
(1)用RT-PCR和qRT-PCR的方法检测HOXA1 mRNA的表达水平。
(2)运用Western blot和流式细胞术(FCM)检测HOXA1蛋白表达水平。
结果：
1.与非转化对照细胞16HBE-N相比,anti-BPDE恶性转化细胞16HBE-T有54个miRNA表达异常,46个表达上调,9个表达下调。表达上调前5位miRNA分别为miR-494、miR-320、miR-498、miR-129和miR-106a;表达下调前3位miRNA分别是miR-10a、miR-493-5p和miR-363*。
2.miR-10a扩增标准曲线为：Y=-3.453×LOG(X)+52.10,Ct值与阳性模板的相关系数为0.999,扩增效率为94.8％。miR-320扩增标准曲线为：Y=-3.243×LOG(X)+44.14,Ct值与阳性模板的相关系数为1.000,扩增效率为103.4％。以U6 snRNA为内参,采用△△Ct法对基因表达进行相对定量,anti-BPDE恶性转化细胞16HBE-T miR-10a和miR-320基因表达分别是非转化对照细胞16HBE-N的0.01倍和8.06倍。
3.anti-BPDE恶性转化细胞16HBE-T的HOXA1 mRNA表达量分别是非转化对照细胞16HBE-N的3.12倍(RT-PCR)和8.75倍(qRT-PCR),16HBE-T的HOXA1蛋白表达量分别是16HBE-N的1.21倍(Western blot)和3.48倍(FCM)。
结论：
1.anti-BPDE恶性转化细胞16HBE-T差异表达miRNA有54个,45个表达上调,9个表达下调。表达上调前5位miRNA分别为miR-494、miR-320、miR-498、miR-129和miR-106a,表达下调前3位miRNA分别是miR-10a、miR-493-5p和miR-363*。miR-17-92、miR-106-363和let-7基因族表达也明显上调。这些miRNA可能参与子细胞恶变的过程。miRNA表达谱结果得到miRNA逆转录定量PCR方法的验证。
2.HOXA1基因3UTR存在2个高度保守序列,与miR-10a种子序列精确配对,是miR-10a的潜在作用靶点。anti-BPDE恶性转化细胞16HBE-T中miR-10a表达下调,HOXA1表达上调,推测miR-10a以抑癌基因的形式反向调控HOXA1,参与化学物诱导的细胞恶变进程。