第一部分：单纯FSH缺陷患者的临床特征及治疗经过目的：根据患者临床特征,明确单纯FSH缺陷这一罕见疾病的诊断标准及治疗原则；通过对自然界建立的极低水平FSH模型的研究,进一步揭示FSH的生理功能及其在卵泡优势化过程中必不可少的作用。方法：嘱患者停止任何内分泌药物治疗三个月后,晨起8时,来我院接受下述检查：ACTH、TS、GH及GnRH兴奋试验以评估垂体功能；性激素、B超检查以评估卵巢功能；染色体、垂体核磁及肾上腺超声检查以鉴别诊断及明确病因。其中,性激素采用化学发光免疫分析法进行检测。检测过程均由西门子公司仪器自动完成。征得患者本人同意后,利用B超及性激素检查,动态监测促排助孕过程中卵泡发育情况,根据卵泡发育调整用药剂量,绘制治疗过程中卵泡发育变化图及性激素波动曲线。结果：1、患者临床特征1.1临床症状：原发性闭经、原发性不孕1.2体格检查：似阉人体征、乳房发育Tanner Ⅲ级。妇科检查：子宫发育不良,大阴唇发育正常,小阴唇发育较差,双附件未扪及异常。1.3家族史：患者父母为姨表近亲,家族无月经紊乱病史。1.4实验室检查1.4.1卵巢来源性激素(人工周期治疗停止3个月)：FSH0.08-0.47mIU/ml、LH27.11-64.53mIU/ml、E216.62pg/ml、T37.44ng/dl、 PRL20.67ng/ml、P0.07ng/ml、AMH3.05ng/ml、INB1.23↓pg/ml。1.4.2肾上腺来源激素(未服用任何类固醇激素类药物)：DHEA2150↓nmol/1、AN6.06T nmol/1.1.4.3垂体来源激素：ACTH、TSH、GH均正常。1.4.4GnRH兴奋试验：戈那瑞林注射30分钟,LH达峰值,较基础值(49.89)升高4倍左右(>200)；而注射前后FSH无波动。1.4.5染色体核型分析：46,XX1.5影像学检查：垂体核磁、肾上腺超声均未见明显异常。(人工周期治疗停止3个月)B超提示子宫发育不良(2.8×2.1×1.9cm3),双侧卵巢内直径≤3mm的窦卵泡数6个。2、患者治疗结局经过妈富隆降低内源性LH水平+尿促性腺激素促排助孕治疗两周期,患者左右卵巢内最大卵泡直径可达1.9cm,血清E2可达735pg/ml, HCG后可成功排卵,但均未妊娠。结论：1、依据疾病的上述临床特征,可将患者确诊为单纯FSH缺陷。2、尽管FSH水平极低,但LH水平较高,这一现象从某一侧面提示,病因可能并非源于下丘脑层面。3、GnRH兴奋试验结果提示,垂体对促性腺激素的合成及分泌功能正常。由此可以推测,FSH的极低水平,可能与编码其自身的基因存在缺陷有关。4、在体内几乎无FSH存在的情况下,本例患者卵巢内仍有6枚早窦卵泡(<3mm)。这提示,早窦卵泡可能与窦前卵泡一样,均为非激素依赖性生长卵泡。第二部分：患者及其家系全外显子基因测序目的：通过对患者及其家系进行FSHβ亚基全外显子基因测序,了解编码FSHβ亚基的基因是否存在突变,以验证单纯FSH缺陷的病因来源于编码FSHβ亚基的基因层面。方法：将采集到的患者及其家系全血样本,置于EDTA抗凝管中,冰盒运输至华大基因公司。利用sanger测序技术——双脱氧末端终止法,对患者及其家系进行FSHβ亚基全外显子测序。结果：患者及其家系FSHβ亚基全外显子测序结果：无义突变：三号外显子第184位核苷酸发生C-T突变,致使原本应编码97位精氨酸的密码子被提前出现的终止密码子取代(Arg97X),该无义突变截断了97-111位氨基酸的表达。患者为Arg97X纯合突变基因型,患者外祖母、父母、姐姐均为Arg97X杂合突变基因型,患者祖父的FSHβ亚基未发生任何突变,为野生型。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP):患者及其家系六人当中,3号外显子第69位核苷酸均发生了C-T纯和突变,经查证,该同义突变在中国人群的发生概率为69.5%,为单核苷酸多态性位点。结论：1、根据患者临床特征及其双亲不良妊娠史,推断Arg97X纯和突变属于单纯FSH缺陷多种基因突变类型中较为严重的可致死亚型,即使少量纯合突变的后代可存活,亦因生育功能的丧失注定被自然界淘汰。2、根据已揭示的FSHβ晶体结构的部分内容,推断Arg97X突变既破坏了FSHβ亚基的稳定性,又抑制了a-β异源二聚体的形成,进而影响FSH免疫及生物活性的发挥。第三部分：野生型及Arg97X突变型FSHβ亚基体外验证实验目的：通过基因扩增、载体构建及细胞转染技术,构建可编码Arg97X突变型FSH的细胞模型,为研究该突变对FSH免疫活性及生物活性的影响打下基础,为揭示FSH生理功能及空间结构的全貌提供依据。方法：1、设计引物：根据第二部分测序结果,设计出野生型及突变型FSHβ基因片段的两对引物。为使质粒所携带目的基因的转录、翻译过程与待转染细胞内源性基因的转录、翻译区分开,拟在目的基因3’端插入HIS标签。由此,野生型FSHβ及突变型FSHβ的正向引物相同,反向引物不同。2、基因扩增：以人体子宫肌瘤组织中提取的RNA为模版,根据上文设计的两对引物,分别进行基因扩增。对获得的DNA产物进行纯化,以获取野生型、突变型FSHβ基因片段。3、载体构建：利用HindⅢ、EcoRI,分别对获得的野生型(wide type)、突变型(mutant)FSHβ片段及pcDNA3.1(+)载体进行双酶切。然后,利用T4连接酶将野生型FSHβ片段、突变型FSHβ片段分别与pcDNA3.1(+)上相应的酶切位点结合,以获得pcDNA3.1(+)-FSHp (WT)及pcDNA3.1(+)-FSHP(MU)载体。4、细胞转染、CR%western-blot、化学发光法：将三组质粒：pcDNA3.1(+)-FSHβ(WT)、 pcDNA3.1(+)-FSHβ(MU)、pcDNA3.1(+)空质粒(CK)瞬时转染进中国仓鼠卵巢细胞内,培养72小时后,提取细胞裂解液行PCR及western-blot检测,提取细胞培养上清行化学发光检测,分别判断质粒是否转染成功?突变型FSHβ基因能否在细胞内成功进行转录、翻译?能否分泌入上清并发挥免疫功能?结果：1、细胞裂解液PCR结果：WT组检测到了野生型FSHβ的mRNA,证实野生型FSHβ可在细胞内成功转录；MU组检测到了突变型FSHβ的nRNA,证实Arg97X突变型FSHβ可在细胞内成功转录；CK组既未检测到野生型FSHβ的mRNA,也未检测到突变型FSHp的mRNA,提示该组样品内无FSHβ(带有HIS标签)转录发生。2、细胞裂解液western Blot结果：WT组检测到了野生型FSHβ蛋白表达,证实野生型FSHβ可在细胞内成功翻译；MU组检测到了突变型FSHβ蛋白表达,证实Arg97X突变型FSHβ可在细胞内成功表达；CK组未检测到带His标签的蛋白表达,提示空质粒组无目的蛋白表达。3、细胞培养上清化学发光法检测结果：四组(WT、MU、CK、media)上清中,均能检测到FSH,且FSH介于1.92-2.12mIU/ml之间,差异无统计学意义,提示化学发光法检测到的FSH可能来源于DMEM/F12培养基,WT及MU组上清中未检测到具有免疫活性的FSHp。结论：1、上述结果证实,pcDNA3.1(+)-FSHβ(WT)及pcDN A3.1(+)-FSHβ(MU)载体构建成功。野生型及突变型FSHβ基因均可在细胞内成功转录、翻译,但均无法由胞内分泌到胞外。2、野生型FSHβ亚基分泌失败,提示只有当a及p亚基结合后,FSH、甚至所有糖蛋白激素,方能分泌出胞外,发挥免疫及生物学功能。3、在患者体内存在正常数量α亚基的情况下(患者TSH水平正常),Arg97X突变型FSHβ亚基仍无法由垂体分泌至外周血液循环,提示该突变的存在,破坏了a及p异源二聚体的结合,进而影响了FSH免疫及生物学功能的发挥。