本研究在家蚕全基因组框架图的基础上，应用生物信息学、EST、全基因组芯片分析研究雌雄的差异选择性剪接和雌雄的差异表达，追寻性别决定关键基因，探讨家蚕性别决定分子机制。获得的主要结果如下： 1.家蚕基因组中性别决定同源基因的鉴定。 将果蝇所有性别决定基因在家蚕基因组中进行同源性分析，以鉴定家蚕性别决定基因。结果显示，22个性别决定基因在家蚕基因组中具有同源体，并且除Sxl外，其它同源基因都有EST表达证据。此乃首次从家蚕基因组水平大尺度鉴定家蚕性别决定同源基因。 比较分析家蚕与果蝇性别决定调控网络，在性别决定初级信号的基因中，da、emc、gro、sisB、run和dpn在家蚕中具有同源体，而her、sisA和sisC在家蚕中没有同源体，这也许反映了家蚕没有使用X∶A作为性别决定初级信号，与经典遗传学研究认为家蚕性别决定初级信号为单一的Fem基因的结果相一致；在剂量补偿途径中，3个基因msl3、mle和mof在家蚕中具有同源体，msl1和msl2基因在家蚕没有同源体，这进一步证明了家蚕缺乏剂量补偿机制；在体细胞性别决定途径中，9个基因Sxl、tra2、dsx、ix、Rbp1、doa、snf、vir和fl(2)d在家蚕中均有同源体，仅tra基因在家蚕中没有同源体，这反映了体细胞性别决定在家蚕中可能较为保守，但个别基因及其调控已发生变化；在求偶行为和种系性别分化途径中，4个基因fru、dsf、ovo和otu在家蚕中都有同源体，表明这两条途径在家蚕中可能很保守。综上述，在性别决定网络中，下游基因大部分在家蚕中存在同源基因，较为保守，而上游基因只有部分基因在家蚕中存在同源基因，变化较大。这从一个方面也证实了Wilkins所提出的性别决定遗传网络由底部向顶部进化的趋势。 2.家蚕性别决定同源基因Bmtra2和Bmix的选择性剪接分析。 通过EST与基因组序列比对分析，鉴定了家蚕235个基因的277个选择性剪接体，分析结果表明，选择性剪接在家蚕基因组中广泛地调控生物学功能。在这些基因中，家蚕性别决定重要基因Bmtra2和Bmir也被鉴定具有选择性剪接。 对于Bmtra2基因，鉴定了其的三种mRNA形式，分别命名为Bmtra2-PA、Bmtra2-PB和Bmtra2-PC。Bmtra2-PA编码蛋白与果蝇TRA2有61﹪的一致性，具有类似的1个RRM结构域和4个RS结构域。基因的外显子与内含子边界位点在物种间也相当保守。Bmtra2-PB与Bmtra2-PA相比，在第2内含子发生了一个可变3’位点类型的选择性剪接，从而Bmtra2-PB编码蛋白比Bmtra2-PA多11个氨基酸残基，这11个氨基酸残基紧邻于第3个RS结构域，这样就改变了RS结构域附近空间结构。因此，Bmtra2-PB的这种剪接体可能调控RS结构域的蛋白—蛋白间相互作用的活性。Bmtra2-PC与Bmtra2-PA相比，在第7内含子发生了一个可变3’位点类型的选择性剪接，从而使Bmtra2-PC的编码蛋白在C端不同。从分析结果看，Bmtra2在基因结构和蛋白质相似程度以及结构域方面很保守，表明家蚕Bmtra2可能执行与果蝇tra2类似的功能，即在性别决定网络中具有调控作用。此基因的选择性剪接可能反映了其在性别决定中较为复杂的调控方式。 通过EST与基因组比对分析，鉴定了家蚕Bmix基因的2种mRNA形式，分别命名为Bmix-PA和Bmix-PB。Bmix-PB编码192个氨基酸，与果蝇Ⅸ具有50﹪的一致性。Bmix-PA与Bmix-PB相比，发生了一个外显子保留/缺失类型的选择性剪接，使Bmix-PA多了第4外显子，该外显子含终止密码子，故Bmix-PA编码72个氨基酸。RT-PCR显示Bmix-PB在家蚕精巢和卵巢中都表达，Bmix-PA在精巢中表达、在卵巢中不表达。Bmix在家蚕生殖腺中雌雄差异表达模式与其在性别决定中发挥作用相符合，表明其可能在家蚕性别决定中起较为重要的作用。 3.基于全基因组芯片的雌雄基因表达谱分析。 运用包含22987个基因探针的全基因组芯片，对家蚕五龄第3天精巢和卵巢进行3次独立的表达谱分析。芯片结果显示，家蚕性别决定同源基因gro、sisA、dsf、runt在家蚕卵巢中表达上调，emc、Sxl、ix、fru和ovo在家蚕精巢中表达上调，da、dpn、msl3、mle、mof、tra2、Rbp1、doa、snf、vir、fl(2)d和otu无表达差异。所鉴定的雌雄差异表达基因应该在家蚕性别决定中具有重要作用。对于差异表达的Sxl基因，其处于性别决定网络中关键位置，可能在家蚕中具有性别决定的关键调控作用。在无表达差异基因中，由于家蚕初级信号的不同以及无剂量补偿，da、dpn、msl3、mle和mof基因应该在家蚕中不发挥性别决定作用；而tra2、Rbp1、doa、snf、vir、fl(2)d和otu在家蚕性别决定中可能不发挥关键的调控作用、仅为辅助因子。 分析家蚕所特有的雌雄差异表达基因结果显示，602个基因为家蚕所特有，其中，199个基因具有功能注释，其余403个为无功能注释基因。在这199个基因，发现这些基因主要包括一些转录因子、精巢特异基因、信号转导蛋白以及大量的功能未知蛋白。 表达谱分析显示，精巢中上调的基因为2776个，卵巢中上调的基因181个。在精巢上调基因中，主要包括精巢特异基因、动力蛋白、酶类基因和功能未知的基因等；在卵巢上调基因中，主要包括母性基因、转录调控因子、储藏蛋白基因和功能未知基因等。这种表达谱反映了家蚕生殖腺的发育和生理过程。 4.家蚕关键性别决定基因BmSxl的cDNA克隆和功能研究。 通过RT-PCR技术，克隆了家蚕BmSxl基因的2种形式的cDNA，分别命名为BmSxl-PA和BmSxl-PB，序列已在国际核酸数据库GenBank上登录，登录号分别为DQ209268.1和DQ209269.1。此2种cDNA全长为2001bp和2440bp。克隆的BmSxl-PA和BmSxl-PB开放阅读框长度分别为1008bp和939bp，编码336和313个氨基酸残基。两个蛋白质均含有两个典型的RRM结构域，但在氨基酸的C-端具有差异。BmSxl-PA编码蛋白与果蝇SXL蛋白质高度相似，有67﹪的一致性。多种昆虫SXL蛋白序列比对结果显示，Sxl基因编码的蛋白在两个RRM结构域区域非常保守，但在N端和C端变异很大。BLAST检索显示，该基因在基因组仅有一个拷贝，说明该基因以选择性剪接方式产生2种mRNA形式，选择性剪接类型为内含子保留/缺失。半定量PCR分析显示BmSxl-PA形式在头、后部丝腺和马氏管中，雄中表达量要高于雌中表达量；BmSxl-PB在生殖腺中，雄中表达量要高于雌中表达量。荧光定量PCR结果显示，BmSxl-PA在精巢和卵巢中表达量显著比其它组织器官要高，且精巢高于卵巢；在头中，雄性表达显著高于雌性。RT-PCR、荧光定量PCR以及芯片结果都显示BmSxl基因在雌雄中差异表达，进一步表明此基因应该在家蚕性别决定中具有关键调控作用。 将BmSxl亚克隆到pET-28a(+)质粒构建原核表达载体，诱导表达的产物经SDS-PAGE电泳后在约36kD的位置比对照多出一条明显表达带，表明目的蛋白得到高效表达，且表达的蛋白绝大部分为包涵体。对该表达蛋白纯化后电泳为单一条带，即得到了纯化蛋白。 5.家蚕性别决定网络调控的推论。 本研究发现，家蚕的Sxl同源基因(BmSxl)在雌雄中差异表达，且在精巢和其它部分雄性组织器官中表达上调。家蚕Bmdsx上游调控因子为一个在雄中活化的未知剪接阻遏物，本研究显示BmSxl在家蚕雄性生殖腺中表达上调，考虑到SXL蛋白本身即为剪接阻遏物，并且发现Bmdsx基因上具有SXL蛋白结合的特征序列，我们推测BmSxl基因在家蚕中可能就担当此活化阻遏物作用，调控Bmdsx。这与BmSxl在雄性头、后部丝腺和马氏管中表达上调也相一致，而且，BmSxl在生殖腺中表达模式与果蝇情况相反，这恰恰符合家蚕遗传交换与果蝇相反，仅发生在雄中。对于BmSxl在家蚕有些组织器官中雌雄表达几乎相同，可能存在某种未知的机制使BmSxl在雌雄表达没有差异。此推测正确与否，有待于进一步的与BmSxl和Bmdsx相关的调控实验证据的支持。