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目的:获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）,简称艾滋病,是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）引发的严重的传染性疾病,主要侵犯人类CD4+T淋巴细胞,使人体逐步丧失免疫功能,最终因各种机会性感染和恶性肿瘤而死亡,目前尚无治愈的方法。HIV具有高度变异性,根据血清学反应和遗传序列差异分为HIV-1和HIV-2型,其中HIV-l又分为四组:M、O、N和P;另外,HIV尚存在近百种循环重组型（Circulating Recombinant Forms,CRFs）和独特重组型（Unique Recombinant Forms,URFs）。高效抗逆转录病毒治疗（Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART）是艾滋病领域取得的最重大突破之一。尽管多数患者能够通过HAART实现病毒学的完全抑制,但仍有部分患者发生病毒学失败。耐药则是致使病毒学失败产生的最主要原因之一。近年来,随着全球抗病毒药物使用的不断推广更新及耐药监测的普及化发展,耐药的发现和部分地区耐药水平的增长趋势使抗病毒药物的使用受到局限,特别是在低中等收入国家（Low-and Middle-Income Countries,LMICs）;同时也使2020年实现联合国艾滋病规划署和世界卫生组织共同设立的90-90-90的目标变得任重而道远。所以,更好地了解HIV耐药发生机制对于改善抗病毒治疗效果及研发更好的抗病毒药物具有重要意义。在HIV耐药检测的方法中,基因型耐药检测是目前应用最为普遍的方法。目前对于HIV不同亚型和重组型毒株的基因型耐药检测结果的判读标准主要是基于HIV-1的B亚型毒株的研究数据。然而,已有许多研究报道指出,亚型之间药物靶区基因的差异可能会影响病毒耐药突变（Drug Resistance Mutation,DRM）产生的通路;同时,亚型之间基因多态性的差异也可影响宿主体内耐药的发生发展,最终使不同亚型毒株表现出一定的特异性耐药特征。这些研究均提示依据B亚型毒株总结的耐药相关的判读标准可能并不完全适用于HIV-1非B亚型毒株。CRF01＿AE是全球最早鉴定且影响最广的HIV-1重组毒株之一。在中国,CRF01＿AE亦是HIV-1的主要流行毒株之一。然而,目前对于CRF01＿AE毒株的特异性耐药相关突变、簇间耐药突变差异、多态性对治疗结果的影响以及突变之间关联性尚缺乏系统的研究。本研究中,我们分析了来自辽宁省的大型抗逆转录病毒治疗的HIV感染者队列中CRF01＿AE毒株pol基因的自然多态性,并比较了治疗失败（Treatment Failure,TF）患者和治疗成功（Treatment Success,TS）患者的序列多态性差异。通过对一线治疗失败的CRF01＿AE感染者的治疗基线及TF时间点pol基因序列的突变情况进行自体前后比较,明确CRF01＿AE毒株获得性耐药突变的特点。此外,我们通过共突变分析和深度测序（Next Generation Sequencing,NGS）技术进一步探索潜在新的耐药相关突变的作用。本研究旨在进一步提高对HIV-1CRF01＿AE毒株的耐药基因型解读水平,为提高我国抗病毒治疗患者耐药监测和治疗管理水平提供科学依据。研究方法:1、研究对象:从2002年1月至2017年12月期间来自辽宁省的HIV-1长期抗逆转录病毒治疗队列中选择具有基线耐药基因型检测数据的2034例CRF01＿AE毒株感染者进行pol-RT基因多态性分析。其中接受一线HAART,即两种核苷类逆转录酶抑制剂（Nucleoside Analogue Reverse Transcriptase Inhibitors,NRTIs）加一种非核苷类逆转录酶抑制剂（Non-nucleoside Analogue Reverse Transcriptase Inhibitors,NNRTIs）治疗的患者1330例,将105例TF患者的pol-RT序列与1148例TS患者的pol-RT序列的比较,分析多态性对治疗结局的影响;选择其中42例接受一线抗病毒治疗方案为替诺福韦（Tenofovir,TDF）/拉米夫定（Lamivudine,3TC）/依非韦伦（Efavirenz,EFV）的TF患者,进行pol-RT序列突变自体前后比较分析及共突变分析,最后选择其中4例在TF时间点同时含有Y181C和L228R突变的患者进行时序性分析。2、序列质量评估、系统进化及基因型耐药性分析:利用Mega7.0的ClustalW对2034例CRF01＿AE患者基线基因型耐药监测获得的HIV-1 pol序列（覆盖蛋白酶区1-99氨基酸和逆转录酶区1-240氨基酸）与Los Alamos HIV数据库（https://www.hiv.lanl.gov/）中下载的参考序列进行比对及手工校正,之后利用Fast Tree v2.1.9软件依据最大似然法构建系统进化树。利用Mega7.0对42例TF患者基线及TF时间点HIV-1 pol序列构建最大似然树。利用美国斯坦福大学HIV耐药数据库（https://hivdb.stanford.edu/）识别DRMs,并使用其中的HIVdb算法（版本8.8）（https://hivdb.stanford.edu/hivdb/by-mutations/）对其耐药相关性质加以解释。3、多态性分析:某亚型未经治疗的毒株的氨基酸与B亚型标准毒株HXB2氨基酸不同,且占比超过1%,则判断该位点为多态性位点。将CRF01＿AE患者基线HIV-1 pol序列的逆转录酶（Reverse Transcriptase,RT）基因编码区中1-240位基因编码氨基酸位点与美国斯坦福大学HIV耐药数据库中未接受抗病毒治疗的B亚型毒株（平均每个自然多态性位点分析46118个分离株）的对应氨基酸位点进行突变频率的比较。同时,对105例TF患者和1148例TS患者基线HIV-1 pol序列的RT区1-240位基因编码氨基酸位点突变频率进行比较。4、共突变分析:使用基于R语言（R version 3.5.2）的CorMut软件包（Version1.25.0）对42例TF患者基线及TF时间点序列进行共突变分析。以HIV-1 B亚型标准毒株HXB2作为氨基酸定位参考序列。选择HIV-1 pol-RT基因编码区中1-240位基因编码氨基酸位点为分析区间。基于选择压力（Ka/Ks）确定阳性选择突变,其中Ka/Ks值大于1为阳性选择,对数比值比（Log odds radio,LOD）大于2认为阳性选择有意义。通过条件选择压力（cKa/Ks）衡量阳性选择突变之间的关联性,其中cKa/Ks>1且LOD>2表示存在共变关系。5、Y181C/L228R突变的时序性分析:按照QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒的操作说明从血浆中提取病毒RNA。为查看HIV-1 pol-RT基因中181位和228位氨基酸突变之间是否存在及存在何种发生发展关系,对RT基因105-256位氨基酸的编码区序列进行聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增。PCR产物纯化定量后,构建深度测序文库,文库经标准化后进行上机检测。在Windows操作系统上,使用Oracle VM Virtual Box-5.2.22软件包构建虚拟环境,运行QIIME2 Core-2018.4（1525276946）对深度测序产生的数据包进行分析,报告每个样本中HIV-1准种的序列及数量,统计RT基因181及228位氨基酸的突变率。6、统计学处理:本研究涉及的基因各氨基酸位点突变率的比较均采用二项分布进行统计学分析。患者自体治疗前后序列中各氨基酸位点突变情况的比较还采用Wilcoxon和McNemar检验。使用SPSS 20.0软件进行其他统计学方面的计算。P值小于0.05表示差异存在统计学意义。结果:1、CRF01＿AE毒株的传播耐药和基因自然多态性特点1.1 CRF01＿AE毒株传播耐药率2034例CRF01＿AE感染患者中,40例在治疗基线时既检出传播耐药突变,传播耐药率为2.0%。常见的传播耐药突变包括K103N、G190S、K101E、T215S、K65R和K219Q。1.2 CRF01＿AE毒株pol-RT基因编码氨基酸自然多态性在RT区（1-240位氨基酸）中发现53个（53/240,22.08%）氨基酸位点存在多态性,其中9个位点（40,68,69,98,103,118,179,210和238）为已知的耐药相关位点。以上序列通过二项分布与美国斯坦福大学HIV耐药数据库（https://hivdb.stanford.edu/cgi-bin/RTMutSummary.cgi,accessed in 04/08/2019）中的未治疗B亚型毒株的RT区的氨基酸自然多态性进行比较发现,CRF01＿AE毒株在RT区的31个氨基酸位点（4、5、6、8、11、28、32、35、36、39、40、43、88、103、104、105、111、118、123、135、172、173、174、177、179、200、203、207、211、214和238位）的突变频率显著高于B亚型毒株（|Z value|≥3）,是CRF01＿AE毒株亚型特异性氨基酸自然多态性位点,其中5个位点（包括40,103,118,179和238）是美国斯坦福大学HIV基因型耐药检测评价系统中列出的耐药相关突变位点,是CRF01＿AE毒株亚型特异性耐药相关的多态性位点。1.3两个CRF01＿AE进化簇的自然多态性的特点通过对2034条HIV-1 CRF01＿AE pol-RT基因序列的系统进化分析发现,这些序列主要属于两个CRF01＿AE进化簇。通过二项分布分析簇间自然多态性差异,发现两个进化簇在自然多态性位点及耐药相关突变位点上均存在差异。2、CRF01＿AE毒株的自然多态性对治疗结果的影响2034例CRF01＿AE患者中共有1330例接受一线HAART,其中TF患者105例（7.89%）,TS患者1148例（86.32%）。通过二项分布比较两组患者pol-RT基因序列氨基酸突变率,发现TF和TS患者之间有13个氨基酸位点的突变频率存在差异,包括仅在TF患者中发现的多态性位点75和189,以及仅在TS患者中发现的多态性位点4,5,8,21,32,49,105,165,169,171和204。其中,TF患者中位点75的突变率显著高于TS患者（|Z value|≥3）。3、一线方案TDF/3TC/EFV治疗失败的CRF01＿AE患者中常见的获得性DRMs和潜在的新DRMs的特征通过系统进化分析显示,42例一线方案为TDF/3TC/EFV治疗失败的CRF01＿AE患者中,每个患者的基线和TF时间点的序列在系统进化树中以患者成簇存在。通过Wilcoxon检验发现,TF时DRMs的数量较基线水平显著增加（Z=-5.604,p<0.001）。在利用二项分布及McNemar检验分析中发现,TF时共有14个位点的突变率显著升高,其中13个位点是已知的耐药相关位点,包括7个NRTI相关位点和6个NNRTI相关位点。在TF时检测到的NRTI相关的DRMs依次为K65R（57.1%）、M184V/I（47.6%）、S68G（26.2%）、A62V（14.3%）、K70/E/R（9.5%）和Y115F（9.5%）;NNRTI相关的DRMs包括G190S/C（66.7%）,K101E/N/Q（52.4%）,V179D/I/A/T/E（45.2%）,Y181C（42.9%）,K103R/N/S（42.9%）和V106M（23.8%）。其中,在耐药相关位点75位点上检测到未知突变V75L,其突变频率在治疗失败时显著增高(Z value=2.494,p<0.05;p McNemar=0.008)。此外,在美国斯坦福大学HIVdb算法中非耐药相关位点228位点检测到一个新的突变L228R,其突变频率在治疗失败时也显著增高(Z value=2.306,p<0.05;p McNemar=0.063)。推测V75L和L228R可能是HIV-1 CRF01＿AE毒株潜在的新DRMs。4、潜在新的耐药相关突变与已知耐药突变间的关联性分析为探索潜在新的DRM是否与目前已知的耐药突变之间存在关联,利用CorMut共突变分析软件包对一线治疗失败时突变率显著增加的14个位点的突变进行关联性分析。其中9个已知的耐药突变（K65R,V106M,Y115F,V179T/E/D,Y181C,M184V和G190S）和2个潜在新的DRMs（V75L和L228R）为阳性选择突变（Ka/Ks>1,LOD>2）。通过条件选择压力分析发现,以上突变之间存在28种强弱不等的关联（cKa/Ks>1,LOD>2）。其中,已知耐药突变Y181C和G190S间的关联性最强(cKa/KsY181C-G190S=22.86,LOD=inf)。L228R与已知耐药突变Y181C的关联性较其他已知突变更强(cKa/KsY181C-L228R=6.00,LOD=4.09)。5、L228R同时或继Y181C之后出现通过深度测序技术分析4例在TF时间点同时具有Y181C和L228R突变的CRF01＿AE患者的纵向血浆样本,以观察Y181C和L228R发生的时序性变化及两者之间的关系。结果显示,2例患者在药物选择压力下仅在TF处同时检测到Y181C和L228R。另一例患者在药物选择压力下,治疗后1个月时首先检出Y181C,在治疗6个月时检出部分毒株同时携带L228R。第四个病例由于测序失败而无法分析。结论:辽宁地区CRF01＿AE亚型HIV-1毒株的传播耐药率较低,CRF01＿AE毒株的高水平自然多态性对治疗结局影响较小。V75L及L228R可能是新的CRF01＿AE耐药相关突变,L228R可能是Y181C的补偿突变。