背景： 恶性肿瘤是当前危害人类健康的重要疾病之一，其特征为异常细胞的失控性生长，并由原发部位向它处播散，这种播散如无法控制，将侵犯重要器官并引起多器官功能衰竭，最后导致机体死亡。因此，如何有效地控制肿瘤细胞的生长及防止其扩散至关重要。临床上除了采用外科手术及放疗外，化疗(chemotherapy)在肿瘤的治疗过程中占有及其重要的地位。自从1946年Gilman和Philips用氮介治疗恶性淋巴瘤，取得显著成效至今，可用于肿瘤化疗的药物不断增多，使肿瘤的化学治疗取得了突破性进展，例如植物来源的抗肿瘤药物——喜树碱类药物、三尖杉酯碱、紫杉醇等化疗药物的应用，使一些不治之症得以治愈。但是，现有化疗药物的高毒、副作用，使一些肿瘤患者的疗效并不显著。为克服化疗药物的毒副作用，提高疗效，人们现已将目光转向了一个独具特色的研究领域——生物毒素的抗肿瘤作用研究，并且已经发现蛇毒、蝎毒等生物毒素都具有较强且广泛的肿瘤杀伤作用，但它们的作用机理，尤其是蝎毒的抗肿瘤作用机理尚不清楚，有待进一步研究。 目的： 该课题通过由蝎毒粗毒中寻找抗肿瘤组分(APⅢ1)，然后探讨其对肿瘤细胞内钙离子浓度的影响，为阐明蝎毒抗癌多肽(APⅢ1)的抗肿瘤作用机理奠定基础。 方法： 一、蝎毒多肽的分离纯化、鉴定、毒性及其抗肿瘤筛选研究 1、分离、纯化、鉴定及毒性研究应用凝胶层析法对蝎毒粗毒进行分离纯化，主要采用SephadexG-50，SephadexG-25通过AKTAexplorer100蛋白快速纯化仪分别进行分离和脱盐，然后冻干保存。SPSepharoseFastFlow层析：从SVⅤ中分离APⅢ1；HPLC分析鉴定层析组分以及蝎毒粗毒和APⅢ1LD50的测定。 2、抗肿瘤活性筛选应用MTT法进行蝎毒各分离组分的抗肿瘤筛选工作，主要观察对人肺癌细胞A549、人低分化胃腺癌细胞BGC-823、人肝癌细胞SMMC-7721及人骨髓细胞白血病细胞HL-60的杀伤作用。 二、东亚钳蝎蝎毒抗肿瘤组分APⅢ1对胞内钙的影响及其机制研究 1、胞内钙浓度检测应用荧光显微镜及流式细胞仪检测在细胞外低钙，高钙和细胞外加入钙离子阻断剂维拉帕米的情况下蝎毒抗癌多肽(APⅢ1)对细胞内钙离子浓度的影响。 2、胞膜钙电流测定应用膜片钳技术，全细胞模式记录蝎毒抗癌多肽(APⅢ1)对肺癌A549细胞膜钙离子通道电流的影响。 结果： 1、东亚钳蝎粗毒经SephadexG-50分离可得到8个组分。其中组分SVⅤ经SepharoseFF柱层析又可分离为峰1～8，其中峰7为APⅢ1。HPLC结果显示出显示出SV由20余个相邻的多肽峰构成，其主要成分来源于峰Ⅳ～Ⅴ，SVⅢ及SVⅥ成分相对较少；APⅢ1主要由1个峰构成，相对纯度为86.35％。蝎毒粗毒及组分APⅢ1的LD50分别为1.838mg/kg、0.846mg/kg。蝎毒组分APⅢ1的毒性较蝎毒粗毒强54％，该结果表明，蝎毒粗毒经过纯化后，其有效成分APⅢ1毒性明显提高。 2、东亚钳蝎蝎毒各分离组分处理细胞后，表现为活细胞减少，代谢MTT的能力降低，。SVⅤ特别是APⅢ1对各种肿瘤细胞的作用较为明显，APⅢ1对人骨髓细胞白血病细胞HL-60及人肺癌A549细胞较为敏感，并呈现出明显的剂量依赖关系。同时对人低分化胃腺癌细胞BGC-823，人肝癌细胞SMMC-7721也具有抑制作用，这与以前所报道的结果相一致。本实验说明，蝎毒粗毒及其组分APⅢ1具有较强的抗肿瘤作用，且组分APⅢ1的抗肿瘤作用较蝎毒粗毒强。 3、APⅢ1对肿瘤细胞内钙浓度的影响维拉帕米组[Ca2+]i高于阴性对照组而低于蝎毒抗癌多肽高、中、低3个剂量组，且统计学差异显著(P＜0.001)，说明蝎毒抗癌多肽升高细胞内[Ca2+]i诱导细胞凋亡过程中，[Ca2+]i升高可能源于细胞外Ca2+的进入和细胞内钙库Ca2+的释放，即蝎毒抗癌多肽可能通过引起细胞膜钙通道开放和结合膜表面受体产生IP3，作用于内质网或线粒体，从而引起细胞内钙库Ca2+释放两条途径达到升高胞浆Ca2+浓度的作用。 4、APⅢ1对胞膜钙电流的影响在钳制电位(holdingpotential，HP)为-30mV，指令电位(commandpotential，CP)在-50mV～20mV，刺激波宽为150ms，频率为0.1Hz的刺激参数下，以跃阶10mV的间距给予去极化脉冲时，记录不同刺激条件下的钙离子通道电流，为避免“run-down”现象的影响，实验控制在加药5min开始记录，10min结束。当电压为0mV时出现最大的峰电流，肺癌A549细胞的钙离子峰值电流为(-28.16±0.01)pA(N=10)，在浴液中加入10mmol/l的verapamil时，几乎90％以上的电流被阻断，进一步确认此内向电流为钙离子电流。当浴液中加入APⅢ1使其终浓度达到100μg/ml时，其峰值电流明显增大，为(-53.93±0.06)pA(N=10)。与对照组比较，其峰值电流升高百分比为191.49％，说明钙离子电流明显增强，钙离子通道参与了细胞内钙离子浓度升高的过程。 结论： 蝎毒粗毒经过SephadexG-50柱可分离到8个组分，组分SVⅤ经SepharoseFF柱层析又可分离为峰1～8，其中峰7为APⅢ1，并发现蝎毒抗癌多肽APⅢ1具有较强的抗肿瘤作用，其机制与肿瘤细胞内钙离子浓度升高从而诱导细胞调亡有关。而钙离子浓度升高与细胞膜钙离子通道活动增强有关，细胞内钙库也可能参与了此过程。本课题的研究将对今后进一步分离提纯及揭示蝎毒抗肿瘤组分的抗肿瘤作用机理提供理论基础。