中国卤虫AS-sdh基因在早期胚胎发育及温度胁迫过程中的表达模式分析

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中国卤虫(Artemia sinica)生活在高盐水体中,其分布主要集中在内陆盐池和盐湖中。卤虫对恶劣环境的抵抗能力非常强,在极端环境下所产的休眠卵可以长时间暴露在高盐、低温、低光照的环境中。  山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase,SDH)利用NAD+作为辅助因子催化多元醇和酮糖之间的转换。SDH可以氧化山梨醇成果糖,并在很多物种的胚胎发育早期的山梨醇合成通路中扮演着重要的角色。在很多昆虫的滞育胚胎中,通常有大量的山梨醇的积累以防止胚胎在低温环境下被冻伤,说明了SDH在胚胎打破滞育,重新进行胚胎发育的过程中有着重要的作用。  本研究采用RACE技术对中国卤虫As-sdh基因的cDNA进行扩增;通过原位杂交技术对As-sdh基因在中国卤虫不同发育时期的分布位置进行分析;通过Real-Time PCR技术对As-sdh基因在中国卤虫不同发育时期和温度胁迫过程中的表达量进行分析;运用MEGA4.0、Clustal等软件和在线软件对As-sdh基因进行信息学分析。  基因克隆实验结果显示扩增得到的中国卤虫As-sdh基因eDNA序列全长为1131bp,包括了28bp的5UTR区和59bp的3UTR区。此基因编码的SDH蛋白含有348个氨基酸残基。生物信息学分析得到此蛋白分子量为37.6KD,理论等电点为7.96,其中催化zinc结合位点和辅酶结合位点高度保守。原位杂交结果显示,此基因的阳性信号在早期胚胎中分布比较广泛,但到达了无节幼体和后无节幼体时期阳性信号主要集中在体表和消化道的内壁。不同发育时期的表达模式分析结果显示As-sdh在0h的胚胎中表达量相对较高,在5d和7d的胚胎中表达量非常高;温度刺激下的表达模式分析结果显示,在温度降低在一个比较小的范围内(25℃-15℃)时,As-sdh的表达量随着温度的降低而升高,在15℃是表达量达到峰值;在温度降低到一个比较极端的范围内(10℃-5℃)时,的表达量随着温度的降低而降低,最终与对照组相当。  本研究得出的结论:中国卤虫sdh基因的zinc结合位点和辅酶结合位点高度保守;表达主要集中在与多元醇代谢有关的肠道内壁和体表;发育过程的表达量分析结果说明在胚胎发育过程中As-sdh在胚胎打破滞育阶段是不可或缺的;低温胁迫表达量分析说明成年虫体对抗寒冷环境的过程中发挥着极其重要的作用。
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