肿瘤新抗原是高度特异性抗原,由体细胞突变产生且不存在于正常细胞中的抗原。肿瘤新抗原能够被人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)分子识别,然后递呈到细胞表面供T细胞受体(T cell receptor,TCR)识别,进而诱导T细胞活化来特异性杀伤肿瘤细胞。目前,国内外对黑色素瘤新抗原的研究进展较多,而对结肠癌新抗原的研究很少,本研究旨在以结肠癌突变为突破口,通过TCGA大数据库分析和外显子组与转录组高通量测序筛选新抗原,然后进行免疫原性验证,建立筛选鉴定结肠癌新抗原的平台,来获得可以作为治疗性疫苗和细胞治疗的候选靶点抗原。我们(1)通过对TCGA数据库中的结肠癌样本数据进行新抗原预测,选择至少在两个样本中出现的突变,利用ANNOVAR对突变进行注释,选择非同义突变,同时获得突变氨基酸所在的蛋白序列。利用NetMHCpan3.0以及NetMHCII 2.2分别进行HLAⅠ、HLAⅡ限制性抗原表位预测。(2)收集20例结肠癌患者的外周血样本、癌旁组织和癌组织,分别进行外显子组和转录组测序。通过Polysolver和HLA*PRG:LA从正常样本中预测出HLAⅠ和Ⅱ分型,然后利用NetMHCpan 3.0和NetMHCII 2.2分别进行HLA Ⅰ、HLA Ⅱ限制性抗原表位预测。(3)将大数据库中预测的结肠癌新抗原和测序预测的结肠癌新抗原进行整合分析,按照一定的标准挑选出潜在的突变抗原肽,进行设计和合成。(4)利用T2-多肽结合实验来探究突变抗原肽与HLA分子之间的结合力。(5)为了探究HLA-抗原肽复合物能否被TCR识别来诱导T细胞活化,采集与HLA分型相匹配的健康志愿者外周血,进行外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分离实验,接着负载多肽,然后通过ELISA、ELISpot、LDH细胞毒性检测等实验验证候选新抗原的免疫原性。结果表明,筛选的新抗原能够诱导抗原特异性T细胞产生,且特异性杀伤负载相应突变抗原肽的靶细胞。提示这些新抗原具有一定的免疫原性,且能够作为免疫治疗的候选靶点抗原。综上所述,本研究首次将TCGA数据库的结肠癌样本和临床结肠癌样本高通量测序数据联合分析来筛选鉴定结肠癌新抗原,与现有的新抗原研究报道相比,大大扩充了新抗原预测的样本与突变数量,并且提高了高频新抗原筛选的准确性,以及具有较强免疫原性新抗原的检出率。本研究成功建立了一个快速筛选肿瘤新抗原的方法平台并应用于结肠癌抗原肽的研究,为治疗性疫苗和细胞治疗提供了新的候选靶点抗原。