植物次级代谢产物的低生产率是制约其细胞培养法产业化生产的核心问题之一。植物体内次级代谢物质的生物合成受到细胞内部和外界因素的影响，至今人们对植物细胞次级代谢产物合成的调控机理的认识还非常有限，相关研究探索有待加强。本学位论文主要以中国红豆杉和三七悬浮培养细胞生产有用次级代谢物云南紫杉烷和人参皂甙为典型研究对象，探讨新近合成的化学诱导剂对植物细胞次级代谢物合成调控的分子机理，这对理解植物培养细胞次级代谢规律和解决其次级代谢物的低产问题具有重要的理论意义和潜在的应用价值。 本实验室前期工作表明，人工合成的新颖茉莉酮酸酯衍生物，例如2-羟乙基茉莉酮酸酯(HEJ)，可大幅度提高红豆杉培养细胞中云南紫杉烷(Tc)的含量和产量[BiotechBioeng，86：595；ibid.，86：809，2004]。本论文通过考察红豆杉细胞被HEJ诱导后防卫信号过氧化氢(H2O2)、茉莉酮酸(JA)的响应情况以及它们是否参与调控紫杉烷Tc的生物合成，研究了HEJ高效诱导红豆杉细胞的作用机理。通过使用H2O2与JA信号产生的抑制剂，考察了H2O2和JA、牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸(GGPP)合成酶(geranylgeranyldiphosphatesynthase，GGPPS)与紫杉二烯合成酶(taxa-4(5)，11(12)-dienesynthase，TS)的基因表达及次级代谢物Tc合成的响应关系，结果表明HEJ刺激了H2O2和JA信号水平与Tc合成的两个关键酶-GGPPS与TS基因转录水平的上调。H2O2产生的抑制剂二亚苯基碘(DPI)抑制了HEJ诱导的H2O2水平与紫杉烷合成的提高，但是并没有抑制GGPPS和TS基因转录水平的上调；JA合成途径抑制剂布洛芬(IBU)，显著抑制了诱导剂诱导的JA水平的增加，同时也抑制了GGPPS与TS的基因转录水平的增加，Tc的合成相应受到抑制。这些结果表明，JA信号在红豆杉培养细胞内影响了这两个基因的转录，从而影响紫杉烷的生物合成；H2O2介导了紫杉烷的生物合成，但是其作用位点有待今后探索。至今有关通过调控防卫信号JA与H2O2水平来考察GGPPS和TS基因转录水平的变化还未见报道。以上信息为红豆杉细胞生物合成紫杉烷途径的深入调控研究提供了一定基础。 新化学合成的苯并噻二唑衍生物作为另一类化学诱导剂可有效促进红豆杉细胞紫杉烷的生物合成[赵振江博士论文，2003]，由此本论文详细考察了其作用机理。实验结果表明，化学合成的新颖苯并噻二唑-7-甲酸三氟乙酯(TFEBTH)诱导了H2O2、JA防卫信号水平上调；对于紫杉烷合成的两个关键酶-GGPPS与TS，其基因转录水平受TFEBTH的正调节。通过使用H2O2与JA信号产生的抑制剂，结果表明H2O2抑制剂抑制了HEJ诱导的紫杉烷Tc合成的提高，但是并没有抑制GGPPS和TS基因转录水平的上调，这说明H2O2可能有其他的作用位点；JA信号影响了GGPPS和TS这两个基因的转录及Tc的生物合成，故TFEBTH诱导的JA对于提高这些关键酶的基因转录水平与Tc的累积是必须的，这一信号传导途径的结论与茉莉酮酸类诱导剂的作用相类似。但是，在水杨酸(SA)信号响应方面，这两类诱导剂表现不同，茉莉酮酸类诱导剂没有诱导SA信号的增强，而苯并噻二唑类诱导剂增强了SA信号，该结果表明这两类诱导剂在诱导防卫信号方面存在差异。根据以上结果，我们认为新的苯并噻二唑衍生物也有望应用于其它植物细胞培养生产有用次级代谢物的体系。 在三七细胞培养中，人工合成的茉莉酮酸酯衍生物有效促进三七细胞皂甙合成同时调节单体皂甙多样性分布[ApplMicrobiolBiotechnol,70：298]，但是，对其作用机理还不十分清楚。因此，本论文研究了HEJ对防卫信号响应与皂甙生物合成途径有关的基因表达的影响以及防卫信号响应与这些基因表达的应答关系。我们着眼于人参皂甙生物合成途径中的两个重要酶-鲨烯合成酶(squalenesynthase，SQS；EC2.5.1.21)和鲨烯环氧化酶(squaleneepoxidase，SE；EC1.14.99.7)的基因以及类异戊二烯生物合成支路上的环阿屯醇合成酶(cycloartenolsynthase，CAS；EC.5.4.99.8)的基因，根据有关这三个基因序列保守性的报道，设计引物获得了它们的部分片断，并检测了诱导后其转录水平的变化。结果表明HEJ诱导的JA是SQS和SE基因转录水平的提高与皂甙的累积所必须的。另一方面，与三七细胞皂甙单体分布有关的两个酶—人参皂甙Rd糖基转移酶(UGRdGT)和原人参二醇-6-羟化酶(P6H)活性能被HEJ激活，JA作为一个信号转导子介导了UGRdGT活性的变化，但没影响P6H活性。对于HEJ激活P6H活性是否通过其它信号转导子还需今后进一步研究。 苯并噻二唑衍生物在应用到三七悬浮培养细胞时，表现出与茉莉酮酸酯衍生物相反的效果，强烈抑制了皂甙的生物合成。为探索这-有趣的现象，以TFEBTH与HEJ为典型对象，在三七培养细胞中，首先比较了这两类化合物诱导的防卫信号响应，即考察了防卫反应SA、JA与苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)的响应情况。结果表明，外源添加的诱导剂TFEBTH诱导了PAL酶活与SA防卫信号反应，但没有激活胞内JA信号的增强，与此相反HEJ诱导剂使胞内JA水平提高，但它没有影响PAL与SA防卫信号反应，我们推测这两个诱导剂诱导后皂甙合成表现出相反的结果与上述防卫信号响应的差异有关。其次，还考察了TFEBTH对皂甙合成途径重要酶-SQS和SE的基因转录水平的影响，观察到与HEJ相似也诱导了这两个基因转录水平的上调。由此我们进一步推测这两类诱导剂在诱导三七细胞皂甙合成中的相反作用效果也可能与皂甙生物合成途径中2,3-氧化鲨烯之后的位点的激活或抑制有关，这还有待实验探索。 总之，本论文获得的关于人工合成的化学诱导剂茉莉酮酸酯衍生物与苯并噻二唑衍生物对三七细胞与红豆杉细胞次级代谢物合成调控的分子机理的有关信息，为今后进一步调控它们次级代谢合成途径奠定了良好基础，也为这些新近合成的化学诱导剂应用到植物细胞培养的生产实践中提供了较为深入的理论基础。