结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)都是重要的威胁公众健康的感染型病原微生物。本文主要针对耐药结核分枝杆菌感染致病的免疫治疗和艰难梭状芽孢杆菌毒素蛋白的结构域及病理机制展开了研究。结核分枝杆菌在全球广泛流行；在我国,结核病是第一大流行性传染病之一。当前,结核病治疗面临的最严峻挑战在于耐药结核菌株特别是多重耐药菌株的出现。由于现有药物治疗方案无法完全清除各种耐药菌株,致使对传染源的控制难度增大,因此,亟需发展新的结核病治疗方案。采用细胞因子调节宿主对入侵病原菌产生免疫应答的免疫治疗法是可能成为临床治疗结核病的潜在有效策略之一。本研究在结核病小鼠模型中评估了细胞因子IL-2、GM-CSF与异烟肼(INH)、利福平(RIF)联合使用治疗结核菌感染的治疗效果。我们首先在药物敏感型结核杆菌H37Rv感染小鼠模型中,通过测定小鼠肺部和脾脏菌落数和分析肺部组织病理程度筛选有效的治疗方案。和未治疗组小鼠对比,经过IL-2或GM-CSF治疗后的小鼠肺部的菌落数分别减少了0.82Log10(P<0.01)和0.58Log10(<0.05),而脾脏的菌落数分别减少了1.42Log10(P<0.01)和1.22Log10(P<0.01)。虽然当单一细胞因子与INH+RIF (HR)联合使用时,并未在抑菌率上表现出任何优势,但是肺部组织病理切片显示联合免疫治疗组小鼠肺部损伤明显减弱。随后,本研究在耐药结核杆菌OB35感染小鼠模型中,通过监测小鼠体重变化、肺部和脾脏菌落计数、以及肺部病理变化评测了免疫治疗法对耐药结核病的治疗效果。和未治疗组比较,免疫治疗能有效降低肺脾菌落数。虽然化学药物HR治疗后小鼠体内菌落数也有所下降,但是只有经免疫治疗后的小鼠肺部才表现较弱的病理性损伤。值得一提的是两种细胞因子共同参与的免疫治疗能比化学药物HR治疗更进一步降低体内菌落数,其中肺部CFU进一步减少1.02Log10(P<0.01),而脾脏CFU进一步减少1.34Log10(P<0.01)。同时,通过对平均体重、存活率以及组织病理程度的分析,我们发现IL-2和GM-CSF共同参与免疫治疗具有协同效应,可有效增强一线药物治疗耐多药结核杆菌感染的效果。艰难梭状芽孢杆菌在发达国家是抗生素治疗引起的院内感染型腹泻的主要原因之一。由于日益增加的发病率和死亡率,艰难梭菌感染(CDI)在全世界已引起了广泛关注。近来出现的高毒耐药菌株更是急剧增加了CDI的发病率,使CDI的治疗和控制面临更严峻的挑战。现阶段对CDI的病理仍然不是很清楚。目前的研究一直认为,从属于大梭菌毒素家族的两个外毒素,毒素A (TcdA)和毒素B (TcdB)是引起疾病的主要原因,但是它们的致病机制以及各自在疾病中的作用意义并不十分清楚。TcdA和TcdB都是多结构域蛋白,主要通过糖基化胞内的Rho GTPase引起宿主细胞中毒。迄今为止发现的毒素功能结构区至少有四个,包括：葡萄糖基转移酶区(GT)、半胱氨酸水解酶区(CPD)、跨膜区(TD)以及受体结合区(RBD)。这四个结构区的功能和致病机制目前尚未完全明确。特别是跨膜区作为毒素最大的结构功能区,涵盖了毒素几乎50%的氨基酸序列,但是至今还未充分阐明其确切的生物学功能和分子机制。基于上述背景,本论文关于艰难梭状杆菌毒素的研究重点涵盖了两大部分：1、艰难梭菌TcdA和TcdB的结构区功能研究。2、TcdA和TcdB致病机制。在第一部分中,我们重点研究了艰难梭菌两个毒素的跨膜区和受体结合区在毒素信号转导通路和疾病发生发展中的生物学功能。我们发现位于跨膜区C端的一段97个氨基酸的片段(D97)对TcdB的细胞毒性起着十分重要的作用。将这个片段的编码序列从TcdB的基因中去除后,表达并纯化得到个截短的毒素蛋白,命名为TxB-D97。实验发现D97片段的缺失并没有影响TcdB蛋白的其它结构功能区的功能,例如,突变毒素和野生型毒素与细胞的结合以及被细胞胞吞的情况基本相似；而且它们在六磷酸肌醇(Insp6)作用下释放GT区效率也一样,同时GT区的糖基转移酶活性在体外的无细胞体系中也表现一致。尽管如此,TxB-D97的细胞毒性和细胞致病性与野生型TcdB相比减弱了至少105。与野生型TcdB不同,TxB-D97不能有效将活细胞中Rac1蛋白糖基化,也不能刺激巨噬细胞分泌TNF-α,而刺激巨噬细胞分泌TNF-α的特性是与细胞质中毒素GT的活性密切相关。同时,用野生型TcdB和突变型毒素TxB-D97分别处理细胞后,用免疫共沉淀方法无法在TxB-D97处理细胞的细胞抽提物中检测到有GT释放。上述实验结果证明位于毒素跨膜区C端紧靠RBD的片段D97是TcdB将GT区运送到细胞质中不可缺少的区域。除D97外,在毒素结构功能区的研究中,为了定义毒素肠毒性与毒素结构区的关系,我们通过交换两个毒素的GT、RBD结构区构建了嵌合体毒素。在一个已成熟使用的小鼠回肠封闭实验模型中,我们严格检查了嵌合体毒素的肠毒性,并对肠道的积水进行了定量分析,检测了炎症细胞因子的诱导分泌,中性粒细胞渗出,肠上皮组织损伤。通过对这些数据的分析我们定义了嵌合体毒素的肠毒性。嵌合体TxdA-Br安装有TcdB的RBD结构区,它在小鼠回肠节中引起了肠组织损伤、大量中性粒细胞渗出,炎症细胞因子表达以及肠积水。而另一个嵌合体TxdB-Ar虽然安装了TcdA的RBD结构区却不能诱发所有肠毒性反应。此外,糖基转移酶活性缺失的突变型毒素aTcdA也基本丢失了其肠毒的活性。这些数据表明TcdA的肠毒性不是由它的RBD结构区决定。在艰难梭状芽孢杆菌毒素第二部分的研究中,我们探讨了TcdA和TcdB在CDI发病机制中的不同作用。在这部分实验中,我们建立了一个巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)小鼠口服模型。利用巨大芽孢杆菌表达单一毒素来替代艰难梭菌,通过灌胃法,使毒素在这种非致病细菌的保护下到达小鼠胃肠道。利用这个实验模型,我们发现表达TcdB的巨大芽孢杆菌,不依赖于TcdA或其它来源于艰难梭菌的辅助因子,能引起小鼠发病和死亡。而TcdB不仅在肠道引起病变而且还引起了肺部严重损伤,这可能与TcdB进入了血液循环表现出全身体循环毒性有关。相比TcdB, TcdA以乎是一个更专一型的肠毒素,它虽然也能进入全身体循环,但是TcdA只在肠道诱发严重病变和炎症反应。从表达TcdA的巨大芽孢杆菌灌胃的小鼠体内收集的血清和胸积水中,我们检测到促炎症细胞因子IL-1β、IL-6、KC和TNF-α的表达水平都显著升高,这充分说明TcdA是一个高炎症性的毒素。综上所述,本研究通过多种分子生物学、免疫学和病理学方法,评价耐药与非耐药结核杆菌感染的细胞因子免疫治疗方案,研究艰难梭菌TcdA和TcdB的结构区的功能,并探讨TcdA及TcdB在疾病病理中的作用。针对结核分支杆菌感染的免疫治疗我们得出初步结论：IL-2和GM-CSF是潜在能提高一线抗结核药物效力的免疫调节剂；同时多个细胞因子参与的免疫治疗将可能成为有效控制耐药结核病的潜在治疗策略。而在艰难梭状杆菌毒素的研究中,我们发现(1)位于TcdB跨膜区C端的一段97个氨基酸的片段(D97)对艰难梭菌TcdB的GT运输到目的细胞细胞质的过程有非常重要的作用；(2)TcdA和TcdB的受体结合区(RBD)不是决定肠毒性的主要功能区,而GT的活性是肠毒性的必要条件之一；(3)TcdA和TcdB分别能独立在体外和体内引起上皮细胞屏障功能障碍,从而增加了细胞旁通路物质流和毒素转运；(4)虽然TcdB不是严格定义上的肠毒素,但是不依赖于TcdA或其它艰难梭菌产生的辅助因子,TcdB也能在体内引起疾病；(5)TcdA和TcdB都能进入血液循环,导致血毒症和严重甚至致命的系统性疾病；(6)与TcdA相比,TcdB炎症性更弱；(7)TcdB是一个毒性强大的体循环系统毒素,能引起肠道和全身组织损伤。这些研究结果填补了艰难梭状芽孢杆菌研究领域的一些知识空白,为进一步了解该微生物毒素蛋白在体内的病理模型奠定了基础。