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赤潮是一种严重的全球性海洋灾害,近年来赤潮发生次数增多,发生区域扩大,赤潮危害加剧。海洋细菌由于其本身的种群多样性、生理生化多样性、生态功能多样性、遗传特征多样性等特点以及同赤潮藻错综复杂的生态关系,在赤潮生消过程中有着极其重要的作用;而近年来细菌杀藻现象的发现为微生物防治赤潮提供了可能途径,从而菌藻关系研究已经成为当前赤潮研究的重点和热点。
本论文研究了一株有毒甲藻——塔玛亚历山大藻培养液细菌群落组成;改良了藻培养液除菌技术;从东海赤潮区分离并筛选到几株能杀死塔玛亚历山大藻的海洋细菌,研究了细菌杀藻的方式;构建了东海赤潮区海水、沉积物样品和红树林区沉积物样品的小片段基因组文库,并进行抑藻克隆子的筛选;获得的主要结果如下:
1.构建了塔玛亚历山大藻培养液中的细菌16SrDNA文库,研究其细菌群落组成。
RFLP分析表明文库中的克隆子分为13个谱型,分别对各谱型代表克隆子序列分析,结果表明塔玛亚历山大藻培养液中细菌分属于12属,主要为变形细菌(61.5﹪),其中γ-Proteobacteria占30.8﹪,α-Proteobacteria占23.1﹪,β-Proteobacteria占7.6﹪;拟杆菌门(Bacteroidetes,23.1﹪)细菌和放线菌门(Actinobacteria,7.6﹪)细菌。
2.有效的改良了塔玛亚历山大藻培养液除菌技术。通过对塔玛亚历山大藻重复洗涤、溶菌酶/SDS处理和抗生素处理,尝试除去了塔玛亚历山大藻培养液中的细菌。通过细菌培养、荧光显微镜观察以及16SrDNA扩增等方法对处理后的藻培养液进行无菌检验,结果均表明没有细菌的存在;同时,我们连续监测了整个生长周期及其后的连续三代培养物,同样也未检测到细菌。这样我们成功的获得了一株无菌的塔玛亚历山大藻培养液。该法较为有效且耗时较少,获得的无菌塔玛亚历山大藻可以在实验室基本培养条件下保存,并进行下一步研究。
3.从东海赤潮区分离并筛选到8株能杀死塔玛亚历山大藻的海洋细菌,这是有关塔玛亚历山大藻杀藻细菌的首次报导。筛选获得的各菌株均属于γ变形菌纲(γ-Proteobacteria),分属于5个属。其中菌株SP31、SP44、SP48属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas);菌株DH12、DH46属于交替单胞菌属(Alteromonas);菌株SP96属于Idiomarina属;菌株DH51属于弧菌属(Vibrio);菌株DH77属于盐单胞菌属(Halomonas)。这是首次发现Idiomarina属、盐单胞菌属(Halomonas)细菌具有杀藻活性。
4.研究了菌株SP48的杀藻谱及方式。结果表明菌株SP48是通过间接方式杀死藻类,该菌在外加有机物(蛋白胨和酵母粉)的存在下可以杀死塔玛亚历山大藻。菌株SP48在2216E培养基中能产生杀藻物质,该物质不是某种酶类,热稳定,在pH3时不稳定。菌株SP48同时可以杀死一株微小亚历山大藻和一株锥状斯氏藻;而对所测试的两株球形棕囊藻、一株东海原甲藻、二株塔玛亚历山大藻均没有杀藻活性。
5.构建了东海赤潮区海水、沉积物样品和红树林区沉积物样品的小片段(4-10kb)基因组文库,分别命名为pUC19-DHseawater,pUC19-DHsediment和pUC19-Msediment。文库平均插入DNA片段大约为7kb,其中东海赤潮区海水、沉积物样品基因组文库分别包含约2万个克隆子,红树林区沉积物文库约包含8万个克隆子。
6.从红树林区沉积物样品的小片段基因组文库筛选到两个具有抑藻活性的克隆子R17-64、R17-70,其中R17-64插入DNA片段为4.5kb,R17-70插入片段约5kb。在IPTG的诱导下,它们能产生可杀死塔玛亚历山大藻的物质。对于插入DNA片段的序列分析正在进行中。
上述研究结果将有助于人们更好的了解细菌和赤潮藻类相互作用的过程和机制;分离筛选到的细菌丰富了杀藻微生物的种类,从环境基因组文库中克隆并筛选到潜在的抑藻基因,为杀藻细菌作用机制的进一步研究奠定了重要基础,并为赤潮的微生物防治提供了可能的潜力巨大的资源与工具。