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目的:Apelin是G蛋白偶联受体APJ的内源性配体。研究表明Apelin/APJ系统在心血管系统中广泛表达且发挥着重要的作用如血压调节、心肌收缩、血管平滑肌增殖、血管生成等。课题组前期研究也发现pannexin1-P2X7途径介导apelin-12、-17、-36浓度依赖性促血小板聚集,而apelin-13抑制ADP诱导的血小板聚集和兔体外血栓的形成。然而有研究显示将apelin-12合成环肽后发现其与apelin自身具有相反的作用,合成环肽后可抑制腺苷酸环化酶(AC)调节的cAMP蓄积以及Akt和ERK1/2信号通路,拮抗apelin的生物学效应。因此,研究apelin各亚型的环肽对兔血小板聚集及体外血栓形成的影响是一个十分重要和有意义的课题。本课题拟探讨apelin亚型环肽对兔血小板聚集及体外血栓形成的影响并深入研究自噬途径参与的机制。课题从自噬的视角揭示数种合成的apelin亚型环肽与血小板聚集及体外血栓形成的关系,深入探讨环肽的可能作用机制,通过发现apelin环肽新的生物学作用,为开发新的稳定和高效的抗血小板药物提供新的思路和依据。方法:1.多肽合成仪合成相应的apelin环肽;2.生物信息学分析合成环肽的特性;3.比浊法分析新西兰兔血小板聚集的程度;4.体外血栓检测仪分析新西兰兔体外血栓形成的现象;5.线粒体荧光探针标记新西兰兔血小板内线粒体数量;6.活性氧荧光探针标记新西兰兔血小板内活性氧生成;7.透射电镜分析新西兰兔血小板内线粒体自噬的情况。结果:1.生物信息系分析发现新合成的apelin环肽均为强碱性或弱碱性的物质,结构不稳定,均为亲水蛋白,环肽的亲水性残基和疏水残基分布不均匀,没有典型的亲水面和疏水面;2.1,12-cyclic apelin-12(0.001μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L)可以浓度依赖性地抑制内源性促凝剂ADP诱导的新西兰兔血小板聚集,本身并不影响新西兰兔血小板聚集;3.二硫-cyclic apelin12浓度依赖性促进兔血小板聚集;4.1,6-cyclic apelin-12浓度依赖性促进兔血小板聚集;5.1,17-cyclic apelin-17促进兔血小板聚集;6.1,36-cyclic apelin-36浓度依赖性促进兔血小板聚集;7.1,12-cyclic apelin-12浓度依赖性地抑制内源性促凝剂ADP诱导的新西兰兔血栓形成;8.1,12-cyclic apelin-12对collagen、thrombin、Arachidonic acid(AA)诱导的兔血小板聚集没有影响;9.自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin Rapa)减弱1,12-cyclic apelin12对ADP诱导的兔血小板聚集的抑制作用,而自噬抑制剂3MA增强1,12-cyclic apelin12的抑制作用;Rapa可促进ADP诱导的兔血小板聚集,而3MA却能抑制ADP诱导的兔血小板聚集;10.1,12-cyclic apelin12不能阻断apelin-12、apelin-17、apelin-36诱导的兔血小板聚集。11.线粒体自噬诱导剂CCCP能减弱1,12-cyclic apelin12对ADP诱导的兔血小板聚集的抑制作用;12.内质网应激诱导剂tunicamycin能减弱1,12-cyclic apelin12对ADP诱导的兔血小板聚集的抑制作用;13.线粒体活性氧清除剂Mito-TEMPO能增强1,12-cyclic apelin12对ADP诱导的兔血小板聚集的抑制作用;14.ADP能诱导兔血小板内线粒体数量减少,而1,12-cyclic apelin12能逆转ADP所诱导的兔血小板内线粒体数量减少;15.ADP能诱导兔血小板内线粒体活性氧含量增加,而1,12-cyclicapelin12降低ADP诱导的兔血小板内线粒体活性氧含量增加;16.透射电镜结果显示ADP能诱导兔血小板内线粒体自噬,而1,12-cyclic apelin12降低ADP诱导的兔血小板内线粒体自噬;17.ADP能诱导人血小板聚集,而1,12-cyclic apelin12能减弱ADP所诱导的人血小板聚集。结论:1.1,12-cyclic apelin12能浓度性地抑制ADP诱导的血小板聚集及体外血栓形成,但本身不能诱导血小板聚集;其他几个新合成的apelin环肽1,6-cyclic apelin-12、二硫-cyclic apelin12、1,17-cyclic Apelin-17、1,36-cyclic apelin-36均能诱导血小板聚集。2.1,12-cyclic apelin12通过抑制线粒体活性氧从而抑制线粒体自噬进而抑制ADP诱导的兔血小板聚集以及体外血栓形成。