研究背景肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是人类最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在人类肿瘤疾病中高居第三位,严重危害人类的健康。HCC致病机制的全面揭示将为制定完善的个体化治疗方案提供理论依据。肿瘤坏死因子αα诱导蛋白 8(Tumor necrosis factor α-induced protein 8,TIPE)分子家族,包括 4个成员:TIPE、TIPE1、TIPE2和TIPE3,已被证实通过调节细胞死亡、增殖、迁移等能力,参与炎症、感染、自身免疫病、肿瘤等多种疾病的发展进程。TIPE1基因位于人染色体19p13.3,编码一个由188氨基酸组成的胞浆蛋白,在多种成年和胚胎组织中广泛表达。TIPE1蛋白于2008年首次被鉴定为可同时调控细胞凋亡(apoptosis)和坏死状凋亡(necroptosis)的候选分子。然而,迄今为止,对于TIPE1蛋白的具体生物学作用研究甚少。研究显示,TIPE1可通过竞争性结合FBXW5,抑制TSC2降解,进而负向调控mTOR活化,促进氧化应激诱导的多巴胺能神经元自噬,可能参与帕金森病的发病过程。我们课题组前期研究发现,肝细胞中TIPE1能够抑制Rac1活化、促进细胞死亡,进而在肝癌进程中发挥抑癌基因作用。然而,目前对于TIPE1在免疫调节方面的作用尚未见报道。实验室前期研究的结果提示,肝癌组织中免疫细胞高表达TIPE1,且具有巨噬细胞样形态。基于此,本课题拟研究肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)中TIPE1蛋白的表达和功能,并初步探讨其分子机制。研究目的本课题主要以肝癌为研究对象,探讨TIPE1调控巨噬细胞活化和功能,参与肿瘤发生的作用机制,为肝癌的诊治和预后评估寻找新靶点。具体研究目标如下:1.检测TIPE1在巨噬细胞中的表达和调控机制;2.明确巨噬细胞TIPE1在肝癌发生中的生物学作用;3.初步探讨TIPE1调控巨噬细胞活化和功能的分子机制。研究方法与结果1.免疫器官和巨噬细胞中可检测到本底水平TIPE1表达目前对于免疫器官和免疫细胞中TIPE1表达情况尚未见有报道,因此本课题首先检测了胸腺、脾脏、淋巴结等免疫器官中TIPE1的表达水平。RT-PCR结果显示,胸腺、脾脏和淋巴结中可检测到较高水平的TIPE1mRNA。因为,课题组前期免疫组化染色发现,肝癌组织中具有巨噬细胞样形态的细胞高表达TIPE1,因此本课题利用免疫荧光双染检测CD68+细胞TIPE1表达情况。结果显示,胸腺、脾脏和淋巴结可检测到大量TIPE1表达阳性细胞,部分CD68+细胞亦可检测到TIPE1蛋白表达。为进一步明确TIPE1在巨噬细胞中的表达情况,分离小鼠6%淀粉诱导的腹腔巨噬细胞和骨髓来源的巨噬细胞,RT-PCR和Western Blot结果显示,均可检测到明显的TIPE1 mRNA和蛋白的本底表达。免疫荧光染色结果亦显示,人单核细胞系THP1中可检测到TIPE1蛋白表达。以上结果提示,TIPE1蛋白在免疫器官和巨噬细胞中具有明显的本底水平表达。2.肝癌组织中巨噬细胞TIPE1高表达,且与患者生存期呈负相关采用免疫荧光双染技术检测TIPE1蛋白在人肝癌组织和相应癌旁组织巨噬细胞中的表达情况。结果发现,TIPE1可表达在部分CD68+巨噬细胞。进一步统计学分析显示,肝癌组织中TIPE1+CD68+巨噬细胞比例显著高于癌旁组织,且TIPE1+CD68+巨噬细胞比例与患者生存期显著负相关,结节型肿瘤中TIPE+CD68+巨噬细胞比例高于巨块型肿瘤,但与肿瘤大小无明显相关性。3.肿瘤微环境上调巨噬细胞中TIPE1表达为了在体外模拟肿瘤微环境,观察其对巨噬细胞TIPE1表达的影响,我们用人肝癌细胞系HepG2,Huh7和小鼠肝癌细胞系H22细胞培养上清制备条件性培养基(hepatocellularcarcinoma Conditioned Medium,HCM)。分别设计不同的时间梯度(0,12,24,48h)和剂量梯度(0,100,200,300μl)作用于人单核细胞系THP1和小鼠原代巨噬细胞PM、BMDM,RT-PCR和Western Blot检测TIPE1的表达情况。结果显示,HCM可显著上调THP1、PM、BMDM中TIPE1的表达,且呈现明显时间和剂量依赖性。4.TGF-β显著增强巨噬细胞中TIPE1的表达TGF-β是肿瘤微环境中一个重要的细胞因子,在肿瘤的发生发展中发挥至关重要的作用。因此,课题进一步检测了 TGF-β对巨噬细胞上TIPE1表达的影响,利用不同剂量TGF-β(0,2.5,5,10ng/ml)作用于人单核细胞系THP1、小鼠巨噬细胞系RAW264.7和原代巨噬细胞PM等,RT-PCR和Western Blot检测TIPE1表达。研究结果显示,TGF-β可显著增强THP1、RAW264.7和PM细胞中TIPE1mRNA和蛋白的表达,且具有剂量依赖性。为进一步明确TGF-β在肿瘤微环境上调TIPE1表达中的作用,我们还利用不同浓度梯度的TGF-β受体阻断剂SB431542(0,2.5,5,10μg/ml)预处理腹腔巨噬细胞,之后再加入条件性培养基HCM刺激,检测PM细胞上TIPE1的表达。结果显示,SB431542可显著抑制HCM诱导的PM中TIPE1表达,且具有剂量依赖性。5.TIPE1可调控巨噬细胞向M2型巨噬细胞的分化为进一步探讨巨噬细胞中T1PE1参与肿瘤发生的机制,同时考虑肿瘤相关巨噬细胞中以M2样巨噬细胞为主,课题研究了 TIPE1在巨噬细胞活化和分化中的生物学作用。首先,分离小鼠6%淀粉诱导的腹腔巨噬细胞PM,分别利用LPS和IL-4诱导产生M1、M2型巨噬细胞,RT-PCR和Western Blot检测TIPE1的表达。结果显示,经LPS刺激PM表达高水平iNOS,而Arg-1表达缺失;相反,经IL-4刺激PM表达高水平Arg-1,IL-4刺激诱导的M2型巨噬细胞高表达TIPE1 mRNA和蛋白,显著高于LPS诱导的M1型巨噬细胞。在此基础上,利用TIPE1小干扰敲减腹腔巨噬细胞PM和骨髓来源的巨噬细胞BMDM中TIPE1的表达,流式细胞术检测M2型巨噬细胞表面标记分子CD206的表达和胞内IL-10的产生。结果显示,TIPE1干扰可显著下调IL-4刺激后的巨噬细胞中CD206的表达和IL-10的产生。同时,TIPE1小干扰尚可下调TGF-β和HCM刺激的BMDM细胞上清中IL-10的分泌水平。6.TIPE1调节巨噬细胞极化相关信号通路在上述研究基础上,课题进一步检测了 TIPE1对巨噬细胞极化相关信号通路分子活化的影响。Western Blot结果显示,TIPE1干扰可显著下调IL-4刺激后的巨噬细胞中STAT6的表达,而上调STAT1的表达。相关文献报道,转录因子STAT1/6则通过调控下游相关靶基因介导巨噬细胞向M1/M2型极化。这提示TIPE1很有可能通过STAT1/STAT6信号通路参与调节巨噬细胞的极化过程。7.巨噬细胞中TIPE1的表达可促进肝癌细胞生长和迁移侵袭为了研究巨噬细胞中TIPE1表达的生物学功能,课题利用TIPE1干扰组或对照组小鼠腹腔巨噬细胞PM和骨髓来源巨噬细胞BMDM培养上清,分别刺激小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞,CCK-8检测其对肿瘤细胞生长能力的影响。结果显示,与对照组上清相比,TIPE1干扰组巨噬细胞培养上清可显著抑制Hepa1-6细胞的生长能力。同时,将TIPE1干扰组或对照组巨噬细胞分别与Hepa1-6细胞共培养,Transwell方法检测Hepa1-6细胞的迁移和侵袭能力。结果显示,TIPE1干扰组巨噬细胞培养上清可明显抑制Hepa1-6细胞的迁移和侵袭能力。8.TIPE1通过影响巨噬细胞TGF-β分泌参与其促肿瘤活性为进一步明确TIPE1调控巨噬细胞参与肿瘤发生的分子机制,课题检测了TIPE1对巨噬细胞细胞因子分泌的影响。研究结果显示,TIPE1干扰可显著下调腹腔巨噬细胞PM和骨髓来源的巨噬细胞BMDM中TGF-β分泌水平。随后,分别利用巨噬细胞特异性TGF-β敲除小鼠或野生型C57BL/6小鼠来源的BMDM与Hepa1-6细胞进行Transwell共培养,观察TIPE1干扰对不同来源巨噬细胞促进肝癌细胞迁移能力的影响。结果显示,TIPE1干扰可显著抑制WT小鼠来源巨噬细胞的促肿瘤迁移能力,而对于TGF-β敲除小鼠来源巨噬细胞的促肿瘤迁移能力无明显影响。研究结论根据上述研究结果,本课题初步明确了 TIPE1调控巨噬细胞参与肿瘤发生作用的分子机制,取得以下研究结论:1.TIPE1在多种免疫器官和巨噬细胞中具有本底水平的表达。2.肿瘤相关巨噬细胞高表达TIPE1,且与患者生存期负相关。TGF-β在肿瘤微环境上调巨噬细胞TIPE1表达中发挥重要作用。3.TIPE1通过调控STAT1/STAT6磷酸化促进巨噬细胞向M2型分化。4.TIPE1可影响巨噬细胞TGF-β分泌进而调控其促肿瘤活性。创新性和研究意义本课题率先系列检测了 TIPE1在免疫器官和巨噬细胞中的表达情况,初步研究了 TIPE1调控肿瘤相关巨噬细胞极化、细胞因子分泌进而参与肿瘤发生的生物学作用,为揭示TIPE1生物学功能提供新数据,为肿瘤免疫治疗提供潜在的靶点。