前言　　先天性肛门直肠畸形（anorectalmalformations,ARMs）是小儿外科常见的消化道畸形，发生率是1/1500-5000，病理改变非常复杂，且疾病谱广，表型多种多样，遗传方式不清楚，病因及胚胎形成机制至今未完全阐明。尽管长期以来人们对肛门直肠畸形的手术方式进行着不断的改进，但中、高位ARMs的术后长期随访显示，仍有许多患者存在不同程度的排便、控便功能障碍。这些问题的发生主要与腰、骶脊髓神经、肛周肌肉群及肠神经系统先天发育缺陷及术中对肛门直肠神经的医源性创伤有关。既往研究显示，ARM患者直肠末端神经肌肉发育异常的发生率高达60％[1]，肠道动力无疑是影响直肠肛管控便屏障最重要的因素之一，研究ARMs肠神经系统、肠道肌肉及神经肌肉联系的发育及其可能的调控机制很有必要。　　近十年来对果蝇、两栖类、哺乳类到人类Wnt族基因，编码产物及其生物学效应的研究表明高度保守的Wnt信号蛋白家族在胚胎发育中发挥着尤其重要的作用，Wnt信号途径参与了从胚胎到成体的一系列控制细胞生长发育及分化的调控。但目前的研究多是涉及人体各个系统发生的常见肿瘤，对于其在调控肠道发育胚胎发育的研究刚刚起步，尤其对于ARMs肠神经肌肉发育调控的机制目前尚不清楚。研究发现Wnt3a及其信号通路可能与ARMs的发生有关，但其对肠管的发育是否有影响，以及具体的调控机制尚不清楚。本研究利用乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)致畸作用建立ARMs胎鼠模型，通过免疫组化，Westernblot及qRT-PCR技术，对ETU致畸胎鼠直肠肛门发育过程中直肠末端Wnt3a基因表达水平进行检测，探讨胎鼠肛门直肠畸形的发生与Wnt3a基因的关系。　　实验材料与方法　　1、实验动物　　体重为220～250g健康成熟Wistar大鼠100只（购自中国医科大学附属盛京医实验动物中心）。　　2、实验试剂　　ETU(纯度99％)（德国Aldrich公司），Wnt3a抗体（abcam公司）;SP二抗试剂盒和DAB显色剂购于北京中杉金桥生物有限公司;β-actin抗体（Sigma公司）;全蛋白提取试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所）;逆转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司）。　　3、实验方法　　在成熟健康Wistar孕鼠妊娠第10天(E10)，按125mg/kg经胃管给予ETU(浓度为1％，以生理盐水做溶剂)，制作ARMs大鼠动物模型，对照组给予等量的生理盐水。分别在大鼠E14、E15、E16、E17、E18、E19剖宫取胎。其中E14、E15、E16胚胎取整个胚胎，E17-E19胚胎取其盆部。部分E17、E18、E19的对照组和ETU组的胎鼠，在解剖显微镜（放大倍数7.5-64倍）下辨别畸形后进一步分为正常组和ARMs组，无菌条件下取直肠末端部分置于EP管中于-80℃深冻保存，备Westernblot及qRT-PCR实验之用。其余标本置于4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定12-36h，常规脱水，石蜡包埋，制成蜡块，连续切片。　　分别进行如下实验:①H&E染色及免疫组化染色，观察正常及畸形大鼠胚胎发育过程及Wnt3a在大鼠胚胎末端直肠的表达情况;②另一部分胚胎通过显微镜下取材获得末端直肠标本，部分进行Wnt3a的qRT-PCR实验，其余部分标本进行Wnt3a的Westernblot实验进行蛋白定量分析，ProtoBlotⅡAP分析系统扫描分析结果，对蛋白质含量进行密度分析，以相对灰度值代表蛋白表达量。所有数据均以均值±标准差表示，差异比较采用SPSS13.0统计软件进行t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。　　实验结果　　免疫组化结果:Wnt3a在正常和ARMs大鼠末端直肠胚胎发育过程的表达，在胚胎发育过程中，Wnt3a基因在正常大鼠肠壁肌间神经丛、肠壁平滑肌及黏膜层均有表达，随胚胎不断发育，表达强度逐渐增强;ARMs组:ARM组E14-E15未见明显阳性细胞，E16-E17表达均较正常组减弱，E18-E19表达与正常组差异更为显著。随着越接近盲肠肠壁内阳性表达细胞畸形组较正常组减少越明显。瘘管周围无阳性反应细胞。Westernblot和qRT-PCR结果:ARMs胎鼠直肠末端组织中Wnt3a蛋白和mRNA表达明显低于正常组(P＜0.05):在17d以后，Wnt3a在正常组和ARMs组都有表达，E17-E19时畸形组的表达较正常组明显减弱，与免疫组化结果趋势一致。　　结论　　先天性肛门直肠畸形的发生可能与Wnt3a基因相关，Wnt3a基因在肛门直肠畸形末端直肠发育过程中表达减弱推测其可能与ARMs胎鼠末端直肠神经发育不良有关。