目的:腰痛是一种年龄相关的退行性疾病,也是最常见的骨骼肌肉系统障碍。它常常导致劳动力的丧失,降低生活质量,带来巨大的社会和经济负担。目前认为椎间盘退变是腰痛的关键病因,其主要病理改变包括髓核细胞的过度凋亡和衰老、氧化应激、基质降解等。但其中具体的病理机制尚未完全阐明,行之有效的治疗药物也很有限。Nrf2是细胞维持内环境稳定的关键转录因子,通过调节靶基因的表达使细胞可以针对应激刺激作出多方面的反应。近年来,由于Nrf2在氧化应激、炎症反应、细胞代谢等方面具有重要的调控功能,越来越多的研究关注它在疾病发生发展中的作用,包括肿瘤、慢性疾病等,并把Nrf2作为这些疾病预防和治疗的潜在靶点。然而,关于Nrf2与椎间盘退变的关系及其在髓核细胞凋亡和衰老中的作用却鲜有报道。之前的研究表明,金线莲苷具有明显的抗炎、抗凋亡的作用,但对Nrf2的调节以及氧化应激下髓核细胞凋亡、衰老的影响却不清楚。因此,本研究拟探讨Nrf2在人不同退变程度的椎间盘髓核组织中的表达变化及其意义,以及在氧化应激所致髓核细胞损伤中的作用,分析金线莲苷对Nrf2信号通路的影响,并进行相应的体外实验,最终为椎间盘退变的机制提供新的见解,也为疾病的预防和治疗提供新的靶点。方法:1.根据患者术前MRI和Pfirrmann分级标准,收集不同退变程度的髓核组织标本。使用免疫组织化学染色和Western blot检测髓核组织中Nrf2、C-caspase3和p16的表达水平,对所得数据进行统计学分析。2.以大鼠髓核细胞为研究对象,使用叔丁基过氧化氢(TBHP)处理髓核细胞,在体外构建氧化应激下凋亡和衰老的细胞模型。通过慢病毒转染,在髓核细胞内分别过表达或敲低Nrf2的表达水平,利用活性氧检测、流式细胞术、β-半乳糖苷酶染色和Western blot分析Nrf2在氧化应激所致髓核细胞凋亡和衰老中的作用。3.使用金线莲苷对髓核细胞进行预处理,通过CCK-8、流式细胞术、EdU染色、MitoSOX染色和Western blot评价氧化应激下金线莲苷对髓核细胞凋亡、衰老和线粒体稳态的影响。通过Western blot检测金线莲苷处理后的髓核细胞内Nrf2及其下游抗氧化蛋白的表达水平,同时检测上游AKT和MAPK信号通路的变化。此外,利用JC-1染色、TUNEL试验、β-半乳糖苷酶染色和Western blot在Nrf2敲低的髓核细胞内验证Nrf2与金线莲苷介导的细胞保护作用的关系。结果:1.随着椎间盘退变程度的加重,Nrf2的蛋白水平在人体髓核组织中逐渐降低,Nrf2免疫阳性的细胞也逐渐减少。相关性分析提示人髓核组织中Nrf2的表达水平与椎间盘退变程度呈负相关。并且,在退变的髓核组织中C-caspase3和p16的表达升高。2.在TBHP诱导的氧化应激下,髓核细胞内C-caspase3和p16蛋白水平的升高呈浓度依赖性和时间依赖性。而在氧化应激下,慢病毒介导的Nrf2缺失使髓核细胞内活性氧含量相比对照组细胞明显升高,同时凋亡细胞和β-半乳糖苷酶染色阳性细胞的数目明显增多,相应地C-caspase3和p16的蛋白水平也升高。相反,当过表达髓核细胞内的Nrf2时,上述改变则受到明显抑制。3.在髓核细胞接受金线莲苷预处理后,氧化应激诱导的细胞凋亡和衰老受到抑制,同时线粒体稳态也得到更好的维持。此外,金线莲苷可以激活Nrf2上游的AKT和ERK1/2通路,促进髓核细胞内Nrf2及其下游抗氧化蛋白SOD2和NQO1的表达。而金线莲苷对Nrf2信号的激活作用可以分别被AKT和ERK1/2通路的抑制剂所阻断。并且,敲低髓核细胞内Nrf2的表达可以抵消金线莲苷在氧化应激下的细胞保护作用。结论:本研究证明了在人椎间盘髓核组织中,Nrf2的表达水平随着退变程度的加重而降低,且两者之间存在负相关关系,提示Nrf2可能在椎间盘退变的发生发展中起着重要作用。作为细胞内关键的抗氧化转录因子,Nrf2可以降低细胞内的氧化应激水平,抑制氧化应激下髓核细胞的凋亡和衰老。值得注意的是,金线莲苷可以通过AKT、ERK1/2通路激活Nrf2,促进髓核细胞内抗氧化蛋白SOD2和NQO1的表达,在氧化应激下抑制髓核细胞凋亡和衰老。并且这种细胞保护作用与髓核细胞内Nrf2的激活密切相关。综上所述,本研究认为Nrf2可能参与了椎间盘退变,为椎间盘退变的发病机制提供了新的见解,也为未来以Nrf2为靶点的治疗策略提供了理论依据。