研究背景维生素D3是目前临床上治疗骨质疏松的常用药物,它在体内通过羟化生成活性代谢产物1,25(OH)2D3(1a,25-dihydroxyvitamin D3)而发挥生理作用。1,25(OH)2D3是一种具有多种生物效应的激素前体,其主要是通过与靶细胞内的维生素D受体(Vitamin D receptor, VDR)结合后调节各种基因的表达,从而发挥其生理效应。它具有促进肠道钙和磷的吸收,促进肾小管对钙、磷的重吸收的作用。它一方面可以协同甲状旁腺激素刺激骨组织脱钙,提高血钙、磷浓度；另一方面也可以抑制甲状旁腺激素的合成释放,从而抑制甲状旁腺激素的骨溶解作用,使骨丢失减少。但是目前关于1,25(OH)2D3对骨形成及成骨细胞作用的报道仍很不一致。部分研究认为1,25(OH)2D3可诱导成骨细胞的分化成熟,对骨组织的形成有直接的促进作用。而另外一些研究则认为1,25(OH)2D3对成骨细胞有明显的抑制作用,直接抑制骨形成。因此,1,25(OH)2D3对骨形成的作用及机制仍需要进一步的研究。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)是一组分泌性的多功能蛋白质,除BMP1外均属于TGF-β(转化生长因子-p)超家族成员,在体内可以通过旁分泌和自分泌的形式诱导骨的形成,是目前公认最强的骨诱导因子。BMP2是其中研究和应用最广泛的成骨生长因子之一,它可以在体外诱导间充质干细胞向成骨细胞分化,体内诱导骨形成。BMP2在启动和调节骨形成中起着关键的作用,因此任何影响BMP2基因表达的因素都可能会影响骨形成。若能阐明1,25(OH)2D3与BMP2基因表达的关系,对进一步理解1,25(OH)2D3在骨形成中的作用会有很大的帮助,目前文献中尚未有此类报道。遗传性高钙尿(Genetic hypercalciuric stone-forming, GHS)大鼠是研究特发性高钙尿(Idiopathic hypercalciuria, IH)患者的理想动物模型,它们都表现为小肠的钙吸收增加,肾脏的尿钙重吸收减少,骨密度减低。既往的研究表明GHS大鼠中肠钙吸收的增加,尿钙重吸收的减少与组织中VDR水平的增加有很大的关系。但是GHS大鼠中骨密度减低的原因仍不是十分清楚。本研究旨在通过探寻GHS大鼠中VDR与BMP2的关系来分析这种动物模型中骨密度减低的可能原因,并进一步探讨1,25(OH)2D3对BMP2基因表达的调控及可能的机制,从而进一步分析1,25(OH)2D3在骨形成中的作用及机制。目的：1、研究GHS大鼠和正常SD大鼠相同组织中维生素D受体蛋白和BMP2mRNA的基础表达水平并进行比较,分析VDR和BMP2可能存在的联系。2、体外培养GHS大鼠和SD大鼠的骨髓基质干细胞,以及UMR-106细胞,研究1,25(OH)2D3对BMP2mRNA表达的影响。3、研究1,25(OH)2D3调控BMP2基因转录表达的作用机制。4、探讨DNA甲基化和组蛋白修饰在1,25(OH)2D3调控BMP2基因表达中的作用。方法：1、选取成年GHS大鼠和SD大鼠,断颈处死,无菌条件下取出股骨和胫骨,抽取骨髓,应用红细胞裂解法及直接贴壁法获取并体外培养骨髓基质干细胞,无菌条件下取出肾脏及小肠,置入液氮中快速冷冻。应用蛋白质印迹(Western blot)法检测GHS和SD大鼠骨髓基质干细胞、肾脏和小肠中的维生素D受体蛋白的水平。应用实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)法检测GHS和SD大鼠骨髓基质干细胞、肾脏和小肠中的BMP2mRNA的表达。2、分别应用1,25(OH)2D3处理体外培养的GHS大鼠和SD大鼠的骨髓基质干细胞和UMR-106细胞,应用qRT-PCR法检测细胞中BMP2mRNA表达的变化。3、应用软件分析BMP2基因转录调控区内可能的VDR结合位点,根据分析结果的基因序列,利用引物设计软件Primer Premier5.0辅助设计相应的扩增引物。4、应用染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immuno-Precipitation, ChIP)检测VDR与BMP2转录调控区DNA的结合,应用方法3中获得的扩增引物对ChIP产物进行PCR扩增,扩增产物进行凝胶电泳分析。5、克隆方法4中获得的BMP2转录调控区内VDR结合位点的基因片段,构建含此基因片段的荧光素酶基因表达载体,通过荧光素酶报告基因检测系统分析此片段的转录活性。6、DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine (DAC)单独或联合1,25(OH)2D3处理体外培养的骨髓基质干细胞和UMR-106细胞,应用qRT-PCR检测BMP2mRNA的表达变化。组蛋白去乙酰酶抑制剂trichostatin A (TSA)单独或联合1,25(OH)2D3处理细胞,应用qRT-PCR检测BMP2mRNA的表达变化。7、1,25(OH)2D3处理UMR-106细胞后提取基因组DNA,应用重亚硫酸盐焦磷酸测序法(Bisulfite pyrosequencing)检测BMP2基因转录调控区CpG位点的甲基化状态的改变。8、1,25(OH)2D3处理UMR-106细胞后,应用染色质免疫沉淀技术检测BMP2转录调控区H3K9甲基化、组蛋白H3乙酰化程度的改变。结果：1、GHS大鼠骨髓基质干细胞、肾脏和小肠中的维生素D受体蛋白的水平较正常SD大鼠明显增加,BMP2mRNA的表达较正常SD大鼠明显降低。2、以10-8mol/L的1,25(OH)2D3分别处理体外培养的SD大鼠和GHS大鼠骨髓基质干细胞6h、12h和24h,与空白对照组比较,BMP2mRNA的表达均明显降低。以10-8mol/L的1,25(OH)2D3分别处理培养的UMR-106细胞1h、6h、12h、24h和48h,与空白对照组比较,BMP2mRNA的表达均明显降低。以不同浓度的1,25(OH)2D3分别处理体外培养的GHS大鼠和SD大鼠的骨髓基质干细胞和UMR-106细胞24h,与空白对照组比较,BMP2mRNA的表达均明显降低。3、软件分析了包括BMP2基因及其侧翼序列在内的共计28,545bp的一段基因序列,共获得8个可能存在的VDR结合位点(Region A-H)。4、以VDR抗体进行ChIP实验,将ChIP产物PCR扩增后,进行凝胶电泳分析显示VDR能结合BMP2转录调控区的Region C片段。5、成功构建了pGL3-Region C-promoter荧光素酶报告基因质粒,将其转染入UMR-106细胞,结果显示构建的pGL3-Region C-promoter荧光素酶报告基因与空白对照的PGL3-promoter相比,表达活性显著降低。1,25(OH)2D3的处理,使报告基因的荧光素酶表达活性进一步显著降低。6、不同浓度(0.5,1,2umol/L)的DAC处理来源于GHS大鼠的骨髓基质干细胞及UMR-106细胞后,均显著上调BMP2mRNA的表达,仅有0.5umol/L的DAC上调来源于SD大鼠的骨髓基质干细胞中BMP2mRNA的表达。但是当与1,25(OH)2D3联合使用时,与单独1,25(OH)2D3处理组相比,较高浓度(1,2umol/L)的DAC均能显著上调三种细胞中BMP2mRNA的表达。7、不同浓度(20,100,500nmol/L)的TSA处理来源于SD大鼠的骨髓基质干细胞后,显著上调BMP2mRNA的表达,而仅有20nmol/L的TSA上调来源于GHS大鼠的骨髓基质干细胞中BMP2mRNA的表达。当与1,25(OH)2D3联合使用处理来源于SD和GHS大鼠的骨髓基质干细胞,以及UMR-106细胞时,与单独1,25(OH)2D3处理组相比,较高浓度(100,500nmol/L)的TSA均能显著上调BMP2mRNA的表达。8、1,25(OH)2D3处理后,重亚硫酸盐测序显示BMP2基因转录调控区RegionC区域的一个CpG位点完全甲基化,而对照组同一CpG位点仍呈去甲基化状态。9、染色质免疫沉淀技术检测显示1,25(OH)2D3处理UMR-106细胞后,提高了BMP2转录调控区Region C区域H3K9甲基化的程度,显著降低了BMP2转录调控区Region C区域组蛋白H3乙酰化的程度。结论：1、在GHS大鼠的相同组织中,与正常SD大鼠比较,VDR水平升高而BMP2mRNA的表达降低。2、在体外培养条件下,1,25(OH)2D3可明显抑制骨髓基质干细胞及类成骨细胞中BMP2mRNA的表达。3、1,25(OH)2D3可通过与VDR的复合,进一步结合BMP2转录调控区的Region C区域,从而抑制BMP2基因的转录表达。4、DNA甲基化和组蛋白修饰协同参与1,25(OH)2D3调控BMP2基因的转录表达过程。