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本实验旨在对分离小鼠腮弓外、中胚层的三种方法进行研究和比较,找出针对不同的实验目的,其最合适的分离方法及其过程,并且对分离的效果进行组织学特殊染色和SEM观测以验证其效果。 本实验以9-30体节时期的小鼠腮弓为实验对象,采用三种方法:方法一为10mM的EDTA(约相当于含0.37224%的乙二胺四乙酸二钠)的PBS溶液调定pH值为7.0,孵育分离腮弓;方法二为0.25%胰蛋白酶的D—hank’s溶液调定pH值为7.0,孵育分离腮弓;方法三为0.125%胰蛋白酶和0.005%的乙二胺四乙酸二钠(约相当于含0.13mM的EDTA)的D—hank’s溶液调定pH值为7.0,孵育分离腮弓。 分别在室温20℃,设定5～7,7～9,9～11,11～13,13～15,15～17,17～19分钟共七个时间段,每个时间段使用三种方法各分离一个胚胎。确定分离的最早最佳时间及分离的操作细节和操作方法。之后,在所获得的最佳分离时间上,获得分离的上皮与上皮下组织,并采用组织病理学切片(HE染色+PAS特殊染色)及扫描电子显微镜的双重方法观测分离效果。 第一种分离液,在8—10分钟20℃的孵育下,成功的将上皮从基底膜上分离下来。方法一可以用于为了获取9-30体节时期的小鼠第一腮弓或上下颌突不含外胚间充质组织或细胞的外胚上皮。 第二种分离液,在13—15分钟20℃的孵育下,可以将上皮带基底膜和基底膜下少量的外培间充质一同分离下来。分离的层次在外胚间充质内,但是接近基底膜。由于操作相对困难,方法二不推荐使用。 第三种分离液,在5-7分钟20℃的孵育下,将上皮连同基底膜和较大量的外胚间充质一同分离下来,所带的间充质比较均匀。方法三可以用于为了获得9-30体节时期的小鼠第一腮弓或上下颌突的不含外胚上皮的组织或细胞的外胚间充质。