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目的：
1.了解温州医学院附属第一医院2002～2008年间临床分离大肠埃希菌的分布情况及耐药特性,为临床抗菌药物选择提供依据。
2.研究2002～2008年每年7～10月不依赖耐药背景的大肠埃希菌临床连续分离株中质粒介导的喹诺酮类耐药基因的分布与变迁情况及其与喹诺酮类抗菌药物耐药的相关性。
3.研究质粒介导的喹诺酮类耐药基因的多态性和遗传变异规律。
方法：
1.回顾性调查2002～2008年间临床分离大肠埃希菌的临床感染分布特点,分析大肠埃希菌的耐药性及变迁情况。
2.PCR筛选质粒介导的喹诺酮类耐药基因(qnr,aac(6’)-Ib-cr,qepA),阳性产物进行DNA测序以确定基因型；接合转移试验探讨质粒介导的喹诺酮类耐药基因的转移性；琼脂稀释法测临床分离菌株MIC,E-test法测受体菌、接合子MIC,分析耐药基因与耐药性的关系。
3.运用生物信息学方法分析质粒介导的喹诺酮类耐药基因的多态性和遗传变异规律。
结果：
1.本研究中514株大肠埃希菌主要来源于尿液标本,占48.4％(249/514),其次为脓液、痰液和血液等；临床常用抗菌药物中,敏感性最好的为亚胺培南(敏感率为99.4％),其次为哌拉西林/他唑巴坦(敏感率为87.5％)和头孢他啶(敏感率为84％),但头孢他啶耐药性具明显上升趋势；耐药率最高的为氨苄西林(不敏感率达94.9％),其次为复方新诺明(不敏感率为76.5％)；庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星、头孢曲松均处于较高耐药水平(不敏感率均在60％以上)；ESBLs的检出率高达57.8％。
2.2002～2008年514株大肠埃希菌临床连续分离株中,对环丙沙星的不敏感率分别为74.6％,65.4％,70.4％,79.7％,70.1％,74.7％,73.1％,对左氧氟沙星的不敏感率分别为71.4％,64.2％,70.4％,79.7％,68.8％,74.7％,73.1％,从2002年开始即处于较高耐药水平,耐药现象严重。
3.514株大肠埃希菌中共检出qnr基因阳性菌株20株,检出率为3.9％,其中两株同时携带qnrB,qnrS基因；qnrA,qnrB,qnrS基因分别检出2株(0.4％),6株(1.2％),14株(2.7％),；经BLAST比对分析,基因型包括qnrS1,qnrB4,qnrB6,qnrA1；未检出qnrC,qnrD基因。qnrA,qnrB,qnrS基因均最早在2002年的标本中检出；35％的qnr基因阳性菌株对环丙沙星敏感,最低MIC仅0.5μg/ml。接合转移试验成功9株,接合子对喹诺酮类药物的MIC均有不同程度的提升,大部分呈低水平耐药,但其中2株接合子呈现高水平耐药。
4.514株大肠埃希菌中,aac(6’)-Ib基因阳性菌株为253株,阳性率为49.2％,从253株aac(6’)-Ib阳性菌株中随机选取134株进行DNA测序、BLAST比对,其中42(31.3％)株为aac(6’)-Ib-cr,18株为aac(6’)-Ib的变异株,其余74株均为aac(6’)-Ib野生型。aac(6’)-Ib-cr基因最早在2002年标本中检出；在环丙沙星敏感和耐药菌株中,产和不产ESBLs菌株中的分布无统计学差异；16.7％的aac(6’)-Ib-cr基因阳性菌株对环丙沙星敏感,最低MIC仅0.03μg/ml。接合转移试验成功10株,接合子对环丙沙星和诺氟沙星MIC均有不同程度的提升,对左旋氧氟沙星MIC无影响。
5.本研究514株大肠埃希菌中未检出qepA基因。
6.基因阳性菌株中,测得的序列与GenBank中已登录的qnr基因家族序列100％同源,不存在突变株。在测序的134株aac(6’)-Ib基因阳性菌株中,18株为aac(6’)-Ib突变株,分为6种亚型,以AF479774为参照序列,涉及到的多态位点有310,322,356,407,411,518,532,535,541bp处,所有序列均已递交至GenBank(登录号为FJ829031,FJ829032,FJ829033,FJ829034,FJ619241,FJ619242)。aac(6’)-Ib基因存在两个相对保守区(60～100aa,140～170aa),两个易变异区(104～119aa,173～181aa),变异频率最高的为119位氨基酸,其次为181位氨基酸。6种类型的突变株与aac(6’)-Ib基因亲缘关系均较近。
结论：
1.所测514株大肠埃希菌仅对少数抗菌药物敏感性较高,对大多数抗菌药物有较高的耐药性,且耐药性有上升趋势,耐药现象比较严重。
2.我院大肠埃希菌PMQR基因以aac(6’)-Ib-cr基因为主,其次为qnr基因,qnr基因中以qnrS为主,基因亚型以qnrS1为主,其次为qnrB4、qnrB6、qnrA1。未检出qepA基因。
3.本研究首次以不考虑耐药背景的大肠埃希菌为研究对象,证实PMQR基因在喹诺酮类耐药和敏感菌株中均存在,喹诺酮类药物敏感菌株中PMOR基因的检出值得关注。
4.首次分析了PMQR基因的多态性,发现了aac(6’)-Ib基因的6种变异型,并发现两个易变异区。