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翼状胬肉(Pterygium)为临床常见病、多发病。目前,翼状胬肉的病因和发病机制尚未完全明了,安全、有效的治疗药物匮乏。许多研究者希望从翼状胬肉致病机制中找到药物治疗的靶点。目前认为此病的发生与紫外线照射密切相关,成纤维细胞被紫外线照射后细胞发生转变而具有侵袭性。另外,变态反应性炎症也涉及其中。有人对翼状胬肉进行基因芯片研究,结果中某些wnt通路相关蛋白基因上调,显示翼状胬肉和wnt通路可能有关联。由于wnt通路在细胞生长增殖、转移、分化等方面的功能,近年来越来越受到关注,特别它是与某些肿瘤的关系研究的比较多。本课题首次以翼状胬肉组织及培养的人翼状胬肉成纤维细胞作为研究对象,探讨wnt通路与翼状胬肉的关系。
目的:探讨β-cateninc(β-连锁蛋白)及c-myc蛋白在翼状胬肉组织及成纤维细胞中的表达情况。
方法:1、利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)的分析工具对前人关于翼状胬肉的基因芯片结果进行分析。
2、利用免疫组化法检测胬肉组织和正常结膜组织中β-catenin及c-myc蛋白的表达差异。
3、通过组织块培养获取成纤维细胞传至第四代,应用相差显微镜和MTT法观察比较正常球结膜与翼状胬肉成纤维细胞生长增殖状况。
4、细胞免疫化学及免疫印迹法检测正常球结膜与翼状胬肉成纤维细胞中β-catenin及c-myc蛋白表达的差异。
5、用10ng/ml tGF-β 1作用于正常球结膜与翼状胬肉成纤维细胞,24小时后,用免疫印迹法比较β-catenin及c-myc的表达变化。
结果:1、对前人关于翼状胬肉的基因芯片结果利用KEGG分析工具进行分析发现:有五个wnt通路相关蛋白基因上调。
2、β-catenin在胬肉组织中较多,且多分布于上皮下纤维血管组织,上皮染色较少。而在正常结膜组织中β-catenin多分布于上皮细胞膜处,上皮下较少。c-myc在胬肉组织中的表达也较多,但在上皮及上皮下组织中均有表达。
3、相差显微镜观察显示第一天及第二天细胞生长密度无差异,第三天起逐渐有差别。MTT检测结果显示,第四代的翼状胬肉与正常结膜成纤维细胞于接种后第一天和第二天的细胞数相比无统计学差异(p>0.05)。但在第三、四、五天,翼状胬肉成纤维细胞的生长较正常结膜成纤维细胞快、增殖能力强,细胞总数多于正常结膜成纤维细胞(p<0.05)4、正常球结膜与翼状胬肉成纤维细胞中β-catenin及c-myc均可见阳性着色,以胞浆内为主。且在翼状胬肉成纤维细胞中两种抗体染色均强于正常结膜成纤维细胞。免疫印迹法显示在翼状胬肉成纤维细胞蛋白中β-catenin及c-myc的特异性阳性条带灰度值均高于正常球结膜成纤维细胞蛋白。
5、经10ng/mL TGF-β 1作用24h后,正常球结膜成纤维细胞β-catenin蛋白表达增加,而c-myc蛋白的表达减少。翼状胬肉成纤维细胞β -catenin及c-myc蛋白的表达均增加。
结论:1、本实验研究结果显示,翼状胬肉成纤维细胞表现出了比正常结膜成纤β-catenin和c-nlyc在翼状胬肉及成纤维细胞中的表达维细胞更强的生长增殖能力,为其具有转化特征的进一步证实。 2、在翼状胬肉组织及成纤维细胞中中β-catenin及c-myc表达均高于正常结膜,提示wnt通路可能与翼状胬肉的发病有关。
3、TGF-β 1刺激后翼状胬肉及正常结膜成纤维细胞B-catenin及c-myc表达变化,进一步证明了wnt通路在翼状胬肉中是激活的,并且与翼状胬肉的发病机制有一定的关系,也进一步证明了翼状胬肉成纤维细胞的转化特性。