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本实验利用RACE-PCR技术克隆了蛤仔HSP60基因全长,结果表明,蛤仔HSP60c DNA全长1777bp(含ploy A序列),Gen Bank登录号:KT987978,包括1728bp的开放阅读框(ORF),21bp的5’端非编码区(5’-UTR)和49bp的3’端非编码区(3’-UTR),编码575个氨基酸,推导蛋白分子量(Mw)为61.25 k Da,等电点(p I)为5.04,N末端无信号肽结构,序列同源性比对发现该基因与已知的HSP60基因序列同源性较高(80%)。本研究首次成功克隆了菲律宾蛤仔的HSP60基因全长,为进一步深入研究蛤仔的抗逆机理及其遗传改良奠定了基础。采用实时荧光定量PCR技术,对HSP40、60、90基因在野生及3种壳色品系(海洋橙、斑马、白蛤)蛤仔的血细胞、闭壳肌、外套膜、足、鳃和消化腺中的表达情况进行了研究。结果显示:HSP40、60、90在野生和3种壳色蛤仔不同组织均有表达。以外套膜中的表达量为对照组,其中,HSP40基因在野生和3种壳色鳃组织中表达水平最高(p<0.01),而在闭壳肌中的表达水平最低;HSP60基因在野生、海洋橙和斑马蛤血细胞中表达量水平最高(p<0.01),在白蛤鳃组织中表达水平最高(p<0.01),在野生和3种壳色蛤仔闭壳肌中的表达水平最低;HSP90基因在野生和斑马蛤血细胞中的表达量水平最高(p<0.01),在海洋橙和白蛤鳃组织中的表达量最高(p<0.01),在野生和3种壳色闭壳肌中的表达水平最低。表明蛤仔HSPs基因家族具有组织特异性的表达模式。研究低盐(15)环境下HSP40、60、90在不同壳色品系蛤仔鳃组织中的表达情况,结果发现:HSP40基因在野生、斑马蛤和海洋橙壳色个体鳃组织中表达量变化表现出相同的规律,均为先升高后下降,又升高达到最高表达量的过程;在白蛤个体的表达量则为先下降后升高的过程。并且,在各个时间点,海洋橙鳃组织中的相对表达量都高于其它三种壳色;HSP60基因在野生蛤仔鳃组织中表达量变化为先上升后下降后又上升的过程,在海洋橙蛤鳃组织中表达量则表现为逐渐上升并在96h时达到最高值(p<0.01),在斑马和白蛤鳃组织表达量变化为逐渐升高分别在24h,72h达到最高而后逐步恢复的过程;HSP90基因在野生、斑马、白蛤鳃组织表达量变化为先上升后分别在72h,12h,72h到达较高值而后逐渐恢复,在海洋橙体内其表达量变化未显示出规律性,说明低盐可以诱导HSP40、60、90基因的高表达。研究了高温和低温(30℃、-1℃)胁迫对不同品系蛤仔HSP40、60、90表达的影响。结果表明:在受到高温胁迫后,HSP40表达量在不同壳色蛤仔鳃组织中表现出相同的变化过程,即为先逐步升高而后逐渐恢复,且在各个时间点,海洋橙的表达程度均高于其它三种壳色;HSP60表达量在野生、海洋橙和白蛤的鳃组织中均表现为逐步升高而后逐渐恢复到正常水平,其中在野生蛤仔内6h达到最高值(p<0.05),而在海洋橙和白蛤96h达到最高表达量(海洋橙p<0.05,白蛤p<0.01)。斑马蛤0-24h维持在较低水平,在48h出现一次高表达量,96h达到最高表达量(p>0.05);HSP90在4种壳色蛤仔鳃组织中表达量变化表现出相同趋势,0-6h持续升高到最高表达量后下降至正常水平。受到低温胁迫后,HSP40表达量在野生群体鳃组织中呈先上升后下降的趋势,在6h达到最高表达量(p<0.05);海洋橙和斑马蛤鳃组织中呈先下降后上升趋势,在24h时达到最高表达量(p<0.05);白蛤鳃组织中0-24h表达量基本保持不变,在48h时达到最高表达量(p<0.05)。HSP60表达量在野生群体鳃组织中表达量基本不变,与空白组持平;海洋橙鳃组织0-24h表达量不变,48h出现高表达量(p<0.01);斑马蛤鳃组织表达量持续下降,72h恢复正常水平;白蛤鳃组织表达量呈下降趋势,48h达到最高表达量(p<0.05)。HSP90表达量在野生群体鳃组织中持续下降,96h恢复正常水平,6h、12h显著低于空白组(p<0.05);海洋橙鳃组织中持续上升,在48h时达到最高表达量(p<0.05),72-96h表达量缓慢下降。斑马蛤鳃组织0-48h之间表达量有所下降,在72h时达到最高表达量(p>0.05);白蛤0-24h之间表达量呈下降趋势,在48h时达到最高表达量(p<0.05),96h表达量恢复正常水平。说明高温和低温均可以诱导HSP40、60、90基因的表达,HSP40、60、90基因均是对温度和盐度敏感的基因。