目的：　　唾液腺腺样囊性癌是发生在头颈部的高度恶性腺上皮来源肿瘤，具有生长缓慢、嗜神经侵袭、局部浸润、血行播散和远处转移等生物学特性。目前临床上对该肿瘤尚无切实有效的治疗方案，复发及转移特性致使其对放化疗均不敏感，是造成患者死亡的主要因素。因缺乏特异性的肿瘤标记物，应用分子生物学手段对其进行靶向治疗难以取得良好的治疗效果。因此唾液腺腺样囊性癌复发及转移发生机制的研究是攻克该肿瘤治疗难题的关键。　　课题组前期研究已经证实PTEN表达缺失在唾液腺腺样囊性癌，特别是恶性程度高、预后差且血行转移率高的实性型中十分常见。PTEN主要通过依赖PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制唾液腺腺样囊性癌细胞的增殖，继而发挥其抑癌作用。利用PI3K/mTOR双重抑制剂特异性阻断该通路后，尽管能够显著抑制人唾液腺腺样囊性癌裸鼠皮下移植瘤的生长，但是对于肿瘤肺转移能力的抑制作用并不十分显著。因此，我们推测PTEN缺失调控唾液腺腺样囊性癌复发和转移的作用并不是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路来实现的，而是存在其它的分子机制。本文旨在利用PTEN敲减SACC-83细胞模型的基因表达谱分析筛选出PTEN敲减条件下的表达差异显著变化的关键性基因，检测这些PTEN下游的靶基因在唾液腺腺样囊性癌组织中的表达及意义，及其对唾液腺腺样囊性癌细胞生物特性的影响，进一步探讨PTEN及其下游靶基因调控唾液腺腺样囊性癌复发及转移的潜在作用机制，为该肿瘤临床治疗和预后评估提供新的可靠的理论依据。　　本研究分为三部分内容，第一部分通过利用基因表达谱分析PTEN敲减SACC-83细胞模型中的差异表达基因，筛选出PTEN下游的靶基因SMC4和WDR66。第二部分通过考察SMC4和WDR66在正常唾液腺及唾液腺腺样囊性癌组织中的表达及意义，探讨二者在唾液腺腺样囊性癌复发及转移中所起到的作用。第三部分通过分析PTEN的靶基因-WDR66对SACC-83细胞的增殖、侵袭及迁移，上皮间质化进程及肿瘤干性标记物表达等生物特性的影响，揭示PTEN负调控WDR66的表达参与唾液腺腺样囊性癌远处转移的调控机制，为唾液腺腺样囊性癌临床治疗和预后评估提供新的理论依据。　　方法：　　1.PTEN敲减SACC-83细胞模型的建立及差异表达基因的筛选与验证　　建立PTEN敲减的SACC-83细胞模型，采用Agilent人全基因4*44K基因芯片分析该细胞模型中基因表达谱的变化，筛选出差异表达基因，并进行GO功能、KEGG信号通路富集及聚类热图分析。利用癌症基因组库检测差异基因在人类头颈部肿瘤及腺上皮来源肿瘤中表达缺失或突变情况，运用实时荧光定量PCR验证PTEN下游的部分靶基因。　　2.PTEN的靶基因SMC4和WDR66在唾液腺腺样囊性癌组织中的表达及其与PTEN表达的相关性　　利用免疫组织化学染色分别检测SMC4和WDR66在20例正常唾液腺及51例唾液腺腺样囊性癌组织中的表达及定位，分析二者与PTEN表达的相关性，以及二者对唾液腺腺样囊性癌患者生存率的影响。　　3.PTEN负调控WDR66对唾液腺腺样囊性癌细胞生物特性的作用　　首先通过特异性阻断PI3K信号通路及利用免疫共沉淀实验检测PTEN调控WDR66的分子机制。随后运用siRNA干扰技术分别或同时敲减SACC-83细胞中WDR66和PTEN的表达，进行CCK-8、Transwell小室和划痕实验等检测WDR66对SACC-83细胞增殖、侵袭及迁移的影响，并利用实时荧光定量PCR和Western Blot检测其对SACC-83细胞的EMT进程及肿瘤干性标记物表达的影响。　　结果：　　1.PTEN敲减SACC-83细胞模型中差异表达基因的生物信息学分析、筛选及验证　　基因芯片分析筛选结果显示，以表达差异倍数＞3倍且荧光值＞300为标准，PTEN敲减SACC-83细胞中共筛选出表达差异显著的基因248个，其中包括64个上调基因和184个下调基因。GO功能分析表明，差异表达基因主要定位于细胞部分及细胞器等，参与多种生物学过程，包括细胞进程、生物调节等，在结合、催化活性等方面所占比重较大。KEGG信号通路富集分析提示，差异表达基因在信号通路、免疫系统及癌症所占比例较大。本研究将重点放在与复发（即DNA损伤修复）和转移（即细胞侵袭迁移）相关的差异基因。聚类热图分析发现，在PTEN敲减SACC-83细胞中富集着一些与DNA损伤修复导致肿瘤复发相关的差异基因，如SMC4、POLQ、CDC25A、CDC6等，与细胞侵袭迁移相关的差异基因，如WDR66、VIM、Zeb1、Zeb2等。　　利用癌症基因组库检测差异基因在人类头颈部肿瘤中表达异常情况，我们发现SMC4和WDR66在腺样囊性癌中存在一定程度的基因扩增。跨癌基因组分析表明，在大多数腺上皮来源肿瘤，如胃腺癌、肺腺癌、结直肠癌、乳腺癌及腺样囊性癌等组织中可检测到SMC4和WDR66不同程度的基因扩增和突变。经过实时荧光定量PCR验证，SMC4和WDR66的mRNA水平显著上调，与基因芯片结果一致，证明芯片数据真实、可靠。　　2.SMC4和WDR66在唾液腺腺样囊性癌组织中的表达、定位及与PTEN表达的相关性　　在正常唾液腺组织中，SMC4和WDR66均特异性表达在腺体组织的导管上皮细胞中，呈胞质表达。在PTEN高表达的筛状型及管状型唾液腺腺样囊性癌组织中，SMC4呈不同程度的胞质表达，阳性率分别为31.3％和33.3％;WDR66几乎不表达。在PTEN表达缺失的实性型唾液腺腺样囊性癌组织中，SMC4呈不同程度的胞质表达，阳性率为40％;WDR66呈强的胞质及胞核表达，阳性率高达70.6％。Spearman等级相关分析显示，SMC4与PTEN在唾液腺腺样囊性癌中的表达无相关性，WDR66与PTEN在唾液腺腺样囊性癌中的表达呈显著负相关。Kaplan-Meier生存分析显示，WDR66高表达唾液腺腺样囊性癌患者与较短的生存率存在显著的相关性。　　3.PTEN负调控WDR66对唾液腺腺样囊性癌细胞生物特性的作用　　结果发现PTEN并不是通过特异性阻断PI3K信号通路进而调控WDR66的表达，WDR66与PTEN之间存在直接的相互作用。CCK-8细胞增殖实验结果显示：与对照组相比，siWDR66转染组的SACC-83细胞增殖受到一定程度抑制，而siPTEN转染组的SACC-83细胞增殖能力显著增强。细胞克隆形成实验结果显示：与对照组相比，siWDR66转染组的细胞克隆形成数量略有降低，而siPTEN转染组的细胞克隆形成数量明显增加。Transwell体外侵袭实验结果显示：与对照组相比，siWDR66转染组穿过小室滤膜的细胞数量显著减少，而siPTEN转染组的细胞数量显著增加。Transwell体外迁移实验结果显示：与对照组相比，siWDR66转染组细胞的迁移能力明显减弱，而siPTEN转染组迁移能力明显增强。划痕实验结果显示：与对照组相比，siWDR66转染组细胞的迁移速度显著下降，而siPTEN转染组细胞的迁移速度显著增加。在敲减WDR66的细胞系中同时敲减PTEN，可一定程度恢复SACC-83细胞的生物学特性至其正常水平。　　实时荧光定量PCR结果显示：与对照组相比，siWDR66转染组E-cadherin的mRNA水平明显增高，Vimentin的mRNA水平略有增高，siPTEN转染组E-cadherin的mRNA水平显著降低，Vimentin的mRNA水平显著增高。与siPTEN转染组相比，siPTEN+siWDR66共转染组的E-cadherin的mRNA水平明显增高，Vimentin的mRNA水平略有增高。Western Blot检测也获得与上述一致的结果。　　实时荧光定量PCR结果显示：与对照组相比，siWDR66转染组的SACC-83细胞肿瘤干性标记物NANOG、OCT4、ALDH1及SOX2的mRNA水平显著降低，siPTEN转染组的SACC-83细胞肿瘤干性标记物NANOG、OCT4、ALDH1及SOX2的mRNA水平显著增高。　　结论：　　1.在PTEN敲减的SACC-83细胞中基因表达谱发生明显的差异性表达，共有248个差异表达基因，其中64个上调基因，184个下调基因。通过生物信息学及癌症基因组数据库分析并筛选出PTEN下游的靶基因，即与DNA损伤修复相关的SMC4和与侵袭、转移相关的WDR66。　　2.SMC4在三种类型唾液腺腺样囊性癌中均呈一定程度的胞质表达，与PTEN的表达及患者的预后均无相关性，SMC4在唾液腺腺样囊性癌的复发中并未发挥重要的作用。在唾液腺腺样囊性癌中WDR66的高表达与患者预后呈负相关，WDR66可能与唾液腺腺样囊性癌的转移密切相关。WDR66在实性型唾液腺腺样囊性癌中的表达显著高于筛状型/管状型，与PTEN的表达呈显著负相关，提示作为PTEN下游靶基因，WDR66在实性型唾液腺腺样囊性癌转移过程中可能发挥重要的作用。　　3.WDR66能显著促进SACC-83细胞的侵袭及迁移，诱导细胞发生EMT，使其获得干性能力，并维持PTEN缺失时的EMT表型及肿瘤干性标记物的表达，WDR66是PTEN缺失时介导致癌作用的下游靶基因，可作为唾液腺腺样囊性癌治疗及预后的新靶点。