变形链球菌乳酸脱氢酶基因及同源区的克隆和序列分析

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龋病的发生与变形链球菌的存在有密切关系。其致龋性的主要特征是能紧密地贴附于牙齿表面,持续地产酸,并能在酸性条件下生存。由于变链能产生LDH,这种酶可以将丙酮酸以发酵的方式转变为乳酸,使菌斑pH值降低,这是龋病损害产生的直接原因。虽然LDH是这一过程的固有酶,但它的活性完全依赖于果糖-1,6-二磷酸的存在。当外源性糖丰富的时候,果糖-1,6-二磷酸增加,使LDH活化,90%以上的葡萄糖被转化为乳酸;外源性糖供应不足时,通过丙酮酸甲酸裂解酶和丙酮酸脱氢酶作用产生甲酸、乙酸、3-羟基丁酮和乙醇。1978年Hillman等学者首先分离出了LDH活性缺乏的变链突变株,并发现这种突变株的致龋性明显降低。并提出用这种菌株取代口腔内固有的变链,起到预防龋病的目的,即龋病的替代疗法。随后许多学者都致力于效应菌株的构建和筛选,但由于早期的研究多局限于使用化学及紫外线照射的方法,得到的突变株在竞争能力和稳定性等方面始终不很理想。随着分子生物学在各个领域的不断发展,学者们开始在基因水平改造LDH。通过一些不太成功的实验,他们发现LDH的完全失活总是伴随着菌体细胞的死亡,其原因可能是一些毒性代谢中间<WP=45>产物的堆积。为了解决这个问题,学者们开始寻找用另一个基因取代之,这一基因就是运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因。与此同时,一种从临床分离出来的具有广泛抗菌谱的变形链球菌引起了学者们的注意,它可以抑制其他致病菌的生长,限制致病菌的粘附,并且它的这种功能与它所能产生的细菌素的量有关。这些性能使它从所有的候选菌株中脱颖而出,成为构建突变株的亲代菌株。在所有的尝试中,较为成功的方法是在体外用乙醇脱氢酶的开放阅读框架取代ldh基因的开放阅读框架,通过载体将其导入变链菌体当中,利用同源重组的方式取代染色体上的 ldh基因。这种方法不仅克服LDH缺陷的致死性难题,而且保证了基因突变的不可复性,同时因为同源重组的可靠定位,避免了影响其他基因产生各种不可预测的变化。通过体外及动物实验验证了这种突变株具有显著降低的致龋性、遗传的稳定性、无毒副作用。在这些学者研究的基础上,为构建国产化的效应菌株,我们改进方法,对变链ldh基因及两侧同源区序列进行了克隆。主要步骤如下:1、变链的培养:将变形链球菌Ingbritt划线接种于MS轻唾平板培养基上。37℃厌氧培养48小时后,用接种环将细菌接种于液体M-S轻唾培养基中,同样条件继续培养<WP=46>48小时。2、染色体DNA的提取:离心1.5ml细菌培养物,收集菌体,用溶菌酶蛋白酶K消化,饱和酚及等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提,NaAC和2倍体积无水乙醇沉淀,70%乙醇洗涤,干燥后溶于TE,-20℃贮存。3、ldh基因及同源区片段的PCR扩增:PCR反应体系为50μl,反应条件为模板DNA 1μl,Ex Taq (5U/μl) 0.5μl,10×Ex Taq buffer(Mg2+ plus)5μl, dNTPs Mixture 4μl,在PCR扩增仪中进行循环反应,94℃预变性3 min,30个循环(94℃30s,55℃30s,72℃1min)72℃延伸10min。5μl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。4、连接反应 :PCR反应产物经回收试剂盒回收,然后取PCR回收产物6.5μl,pMD18-T载体0.5μl,Ligation SolutionⅠ5μl,T4 DNA Ligase 0.5μl,10×T4 DNA Ligase 1.5μl,16℃过夜连接。5、重组质粒的转化:CaCl法制备DH5α感受态细菌,并用连接产物转化,转化产物涂布于Amp+LB(含Amp 50mg/ml)琼脂平板上,37℃培养过夜。6、重组质粒的筛选和鉴定:挑取单个菌落接种于5ml Amp+LB培养基中, 37℃振摇培养过夜。取3.0ml菌液离心沉淀,碱裂解法提取质粒。双酶切(EcoRⅠ/SalⅠ)及PCR鉴定。1%琼脂糖凝胶电泳。7、序列测定:测序结果与Gene Bank中报道的序列同源性为99.1%,说明变链ldh基因及同源区基<WP=47>因已克隆成功;命名该重组质粒为pMD18-T-ldh。为了提高了目的片段和载体之间的连接效率以及目的片段的拷贝数,本实验所选用的载体是pMD18-T Vector,它是由pUC18用EcoRⅤ切割后在两个3’末端加上单个的碱基‘T’而制得的线状分子。而一部分聚合酶如聚合酶Ex Taq通常不依赖于模板在扩增片断的3’末端加上单个的碱基‘A’,A 和T相匹配使目的片段连接到载体上,不但阻止了载体的自身环化,同时也降低了非重组子产生的背景。同时为了保证后续实验中同源重组的发生效率,我们在ldh基因两侧增加了同源区的长度,但同时PCR扩增片段越长越困难,差错率也越高,权衡两方面因素,我们将选取上游同源区为431bp,下游同源区为882bp,目的片段总长度为2.3kbp。替代疗法在预防和治疗细菌感染中具有显著的潜在优势。效应菌株通过对易感组织的持久定植成为宿主正常菌群的一部分,以阻止病原菌对宿主的感染,并以最小的成本对这种疾病提供一生的保护,还可以通过人群内效应菌株的自然传播而提供群体保护。在龋病预防的研究中有关替代疗法,国内尚未见报道。应用这一方法治疗龋病具有广阔的前景和应用价值,我们预期替代疗法的最终成功,将为龋病的预防开辟新的途径,<WP=48>也将推动其在细菌性疾病预防中的应用。
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