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研究背景非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是与肥胖密切相关的慢性代谢性肝病之一。随着肥胖、2型糖尿病发病率的显著增加,NAFLD已成为全球的主要肝脏疾病。依据临床和病理特征,NAFLD包括单纯性脂肪变性(Non-alcoholic fatty liver,NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)两个亚型。与NAFL相比,NASH患者进展为肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌等终末期肝病的风险显著增加。但目前NASH的发病机制尚未完全阐明,尚无针对NASH的有效药物。肝脏炎症是NASH的典型组织病理学特征之一。临床和动物实验均证实,肝脏中性粒细胞浸润增加是NASH的典型组织病理学特征之一,但介导NASH状态下中性粒细胞肝脏浸润的分子机制不清楚。Micro RNA-223(miR-223)是高度保守且化学性质稳定的内源性非编码RNA,在髓系细胞中具有高丰度。临床研究揭示,miR-223的肝脏表达水平在NAFL和NASH组具有显著差异。研究miR-223调控中性粒细胞炎性炎性、介导肝脏炎症的病理生理学功能对于深入揭示NASH发生、进展的分子机制具有重要科学意义。研究目的1.利用三种不同方案诱导NASH小鼠模型,分别评价肝脏组织病理学特征和代谢表型,为研究NASH相关目标基因的病理生理学功能建立动物模型基础2.阐明miR-223在NASH小鼠模型中的组织表达谱3.通过基因功能缺失(loss-of-function)策略,研究miR-223在肝脏代谢性炎症和NASH疾病进展的病理生理学功能4.揭示miR-223调控NASH条件下介导肝组织炎症的天然免疫细胞的炎性反应的分子机理基于以上研究目的,本课题的总体研究目标旨在为以miR-223为潜在靶点研发防治NASH的新型药物(包括创新中药)提供基础研究数据支持。研究策略和方法1.在miR-223基因表达谱的研究中利用实时荧光定量PCR(q PCR)的方法检测标准饲料饲喂的C57 BL/6J野生型小鼠各器官/组织miR-223的表达水平。2.利用三种方法诱导NASH小鼠模型:(1)10周龄C57 BL/6J野生型雄性小鼠以蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食饲喂5周诱导NASH、同时以蛋氨酸-胆碱充足(MCS)作为对照饮食;(2)4周龄C57 BL/6J野生型雄性小鼠以高脂高胆固醇(HFHC)饮食饲喂20周联合单次腹腔脂多糖(LPS)注射诱导NASH;(3)Apo E敲除雄性小鼠以HFHC饮食饲喂20周诱导NASH,均以标准饮食(SC)为对照饮食。运用H&E、Masson染色方法及AST血清生化指标检测方法评价NASH组织病理学特征和肝细胞损伤水平;采用体重监测、血糖试纸检测空腹血糖、葡萄糖耐量、血清TG、TC水平检测等方法鉴定小鼠脂质代谢及系统性代谢表型。3.为研究miR-223在NASH发生和进展中的病理生理学功能,本课题采用基因功能缺失(loss-of-function)研究策略,将周龄匹配的雄性miR-223敲除(miR-223 knockout,miR-223 KO)和野生型(wild type,WT)对照小鼠分别按上述三种方案诱导NASH模型,并利用上述实验方法评价NASH组织病理学特征、脂质代谢及系统性代谢表型。运用q PCR的方法检测MCD、HFHC+LPS诱导模型中C57 BL/6J野生型小鼠肝脏miR-223表达。4.在miR-223调控NASH诱发的天然免疫细胞肝脏浸润和炎症反应的功能研究中,运用免疫组织化学的方法检测三种模型巨噬细胞及中性粒细胞等天然免疫细胞在肝脏的浸润以及中性粒细胞颗粒蛋白MPO、PR3、NE和LCN2在肝脏的表达。运用蛋白印迹的方法检测肝非实质细胞的MPO、LCN2蛋白表达水平。5.在miR-223干预中性粒细胞炎性反应的分子机制研究中,运用q PCR的方法比较miR-223 KO和C57 BL/6J野生型小鼠中性粒细胞及骨髓细胞颗粒蛋白的表达水平;分别分离miR-223敲除和野生型对照小鼠的原代中性粒细胞,运用Transwell方法比较中性粒细胞迁移能力。结果1.MiR-223基因表达谱研究于标准饲料饲喂的C57 BL/6J野生型小鼠中进行的系统性基因表达谱研究结果显示,miR-223在骨髓细胞和中性粒细胞中的丰度较其他器官/组织显著升高,呈现明显的髓系细胞特异性;2.以NASH的关键临床表现和主要组织病理学特征评价三种小鼠NASH模型1)蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食诱导模型(MCD模型)表现出与人类NASH相似的典型肝脏组织病理学特征,包括肝细胞脂肪变性、肝组织炎症、肝细胞气球样变;该模型的部分系统性代谢表型与人类NASH不符,包括体重下降、胰岛素敏感性升高、不伴高脂血症;2)高脂高胆固醇(HFHC)饮食联合单次腹腔脂多糖(LPS)注射模型(HFHC+LPS模型)具有与人类NASH相似的部分肝脏组织病理学特征,包括肝细胞脂肪变性、一过性肝组织炎症,无明显肝细胞气球样变和肝纤维化;伴有显著的糖脂代谢紊乱表型,包括体重增加、葡萄糖耐量受损和血脂异常;3)HFHC饮食饲喂Apo E敲除小鼠模型(Apo E模型)具有与人类NASH相似的部分肝脏组织病理学特征,包括肝细胞脂肪变性、肝组织炎症(轻-中度),无明显肝细胞气球样变;伴有显著的糖脂代谢紊乱表型,包括体重增加、葡萄糖耐量受损、血脂异常。3.MiR-223在NASH发生中的病理生理功能研究结果1)三种NASH模型诱导方案下表型鉴定结果一致显示,miR-223 KO小鼠肝脏炎症和肝细胞损伤较野生型对照组显著加重。MiR-223 KO组的肝组织病理学特征(包括肝脏炎症、气球样变、组织病理学CRN评分)较野生型对照组显著升高、外周血肝功能生化指标AST活性增加(n=6-7/组,P<0.05)。上述结果说明miR-223 KO小鼠对于饮食诱导NASH易感性显著增强,说明miR-223缺失显著加重小鼠的实验性NASH。2)MiR-223 KO组和野生型对照组比较,肝脏脂类代谢和系统性代谢表型无明显差异。代谢表型鉴定数据结果显示,HFHC+LPS模型,miR-223 KO组和野生型对照组空腹血糖和葡萄糖耐量没有显著性差异。Apo E模型,miR-223和Apo E双敲除组和Apo E敲除对照组体重,血清生化指标TG、TC水平无显著性差异。MCD模型,miR-223 KO组和野生型对照组体重、血清生化指标TG、TC水平无显著性差异。说明miR-223缺失对肝脏脂质代谢和系统性代谢表型无明显影响。4.MiR-223调控NASH诱发的天然免疫细胞肝脏浸润和炎症反应的功能研究1)通过免疫组织化学法检测肝组织巨噬细胞标记物F4/80及中性粒细胞标记物,结果显示,在MCD饮食诱发的巨噬细胞及中性粒细胞肝脏浸润水平在miR-223 KO组较野生型对照组显著增加。2)MCD模型,免疫组织化学检测结果显示中性粒细胞颗粒蛋白MPO、PR3、NE及LCN2表达水平在MCD饮食饲喂miR-223 KO组中较野生型对照组显著增加。3)HFHC+LPS模型,免疫组织化学检测结果显示中性粒细胞颗粒蛋白MPO、PR3、NE及LCN2表达水平在HFHC饮食饲喂miR-223 KO组中较野生型对照组显著增加。4)Apo E模型,免疫组织化学检测结果显示中性粒细胞颗粒蛋白MPO、PR3及LCN2表达水平在HFHC饮食饲喂miR-223 KO组中较野生型对照组显著增加。5)MCD模型和HFHC+LPS模型,蛋白印迹检测结果显示在NASH条件下,miR-223 KO组小鼠肝非实质细胞MPO、LCN2表达水平显著增加。5.MiR-223干预中性粒细胞炎性反应的分子机制研究1)通过q PCR方法检测m RNA水平,结果显示:MPO、LCN2表达水平在miR-223 KO小鼠中性粒细胞中较野生型对照小鼠显著性增加。2)核酸检测(q PCR)结果显示MPO、PR3、NE及LCN2表达水平在miR-223 KO小鼠骨髓细胞较野生型对照小鼠显著增加。3)中性粒细胞迁移实验结果揭示:miR-223 KO小鼠中性粒细胞迁移功能较野生型对照小鼠显著增强。结论1.分别以临床肝脏组织病理学特征和其相关的代谢异常为核心评价指标,本课题中诱导的三种NASH小鼠模型(MCD、HFHC+LPS、Apo E)均表现出不同程度的临床NASH关键组织病理学特征和特定代谢表型。综合分析,三种模型分别具有特征和局限;因此,在研究NASH相关基因功能或新型药物临床前评价时,应依据研究目的和重点关注的NASH特征进行选择单一模型或组合应用。2.MiR-223缺失显著加重饮食诱导的肝组织代谢性炎症、显著增加实验性小鼠对于NASH的易感性。3.MiR-223缺失显著增加实验性NASH模型肝组织中巨噬细胞及中性粒细胞等天然免疫细胞的浸润。4.MiR-223缺失显著增加中性粒细胞颗粒蛋白MPO、PR3、NE及LCN2的m RNA表达和蛋白丰度。5.MiR-223缺失显著增强中性粒细胞迁移能力。综上所述,本课题研究结果揭示出:MiR-223可通过抑制中性粒细胞中多个颗粒蛋白的表达而抑制中性粒细胞的炎症反应,显著阻断中性粒细胞-巨噬细胞对话,减缓肝组织代谢性炎症和其诱发的肝细胞损伤,改善小鼠NASH。因此,miR-223及其调控的中性粒细胞颗粒蛋白是研发NASH新药(包括创新中药)的新型潜在靶点。