背景:随着世界范围内生活方式的广泛改变,致使肥胖和胆结石发生率日益增加,导致急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）的发病率呈逐年上升趋势。AP是临床上常见的腹部急症,其特点是起病急,进展快。临床上常将急性胰腺炎分为轻症急性胰腺炎（mild acute pancreatitis,MAP）和重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）,其中重症急性胰腺炎占20%左右。最新资料显示,SAP患者的病死率在13%～35%之间。而急性肺损伤（Acute Lung Injury,ALI）则是SAP最常见的早期并发症之一,ALI可进一步发展为危重的急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS）。入院1周内死亡的SAP患者中有60%死于呼吸功能衰竭,ARDS被认为是造成SAP患者死亡的主要原因之一。目前,国内、外学者将这种由急性胰腺炎所导致的肺损害称为急性胰腺炎相关性肺损伤（Acute Pancreatitis-Associated Acute Lung Injury,APALI）,虽然在APALI的发病机制和药物干预方面的相关研究越来越多,但近年来APALI的治疗效果仍无明显改善,死亡率仍然居高不下。因此,亟待深入探索APALI的发病机制及有效的治疗策略。细胞外冷诱导RNA结合蛋白（Extracellular cold inducible RNA-binding protein,e CIRP）是一种损伤相关分子模式（Damage-associated molecular pattern,DAMP）。在失血性休克或败血症患者中可检测到高水平的血清CIRP,其升高程度与死亡率呈正相关。在功能上,eCIRP可以激活NLRP3炎性小体,加剧炎症性疾病并导致组织损伤。NLRP3炎性小体是一个蛋白复合物,它可以直接与凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）相互作用激活caspase-1,激活的caspase-1裂解活化gasdermin D（GSDMD）,pro-IL-1β和pro-IL-18,导致细胞焦亡和IL-1β以及IL-18的分泌。细胞焦亡是近年来发现的一种新的细胞死亡形式,与炎症有关,可导致疾病进程恶化。肺常驻巨噬细胞,如肺泡巨噬细胞活化产生剧烈炎症反应释放多种炎症介质是ALI/ARDS发病的关键因素。肺泡巨噬细胞焦亡可以通过产生炎性细胞因子IL-1β、IL-18等,加剧肺组织损伤。然而,对于eCIRP是否引能起肺泡巨噬细胞焦亡以及其是否参与APALI的发生发展过程,目前尚无报道,值得进一步探索。历经20余年的探索,本研究组在APALI的发病机制以及中西医结合治疗方案的基础与临床方面的研究证实,应用中西医结合方案治疗APALI,可明显缩短SAP病程,并降低病死率。因此,在SAP、APALI的诊疗方面,将现代医学与祖国传统医学相结合,优势互补,具有广阔的应用前景。经过多年的临床实践和实验研究,“肺与大肠相表里”理论得到充分阐释,并且经后世医家发展,成为中医学理论的重要组成部分之一。研究显示APALI的发生、发展可能与SAP时肠屏障功能发生障碍,肠内细菌和毒素易位后被吸收入血,循环至肺部有关。上述研究结果与中医脏腑相关理论中的“肺与大肠相表里”相关理论不谋而合,即“腑气不通,上逆于肺”,所以从治疗角度上要注重“从肠治肺”,故病变早期治法上以攻里通下为主,引肺气下行以止喘息。中医常用大黄以泻下攻积,清热泻火,故目前临床在中西医结合治疗急性胰腺炎方剂中都配伍中药大黄,而大黄素是大黄的主要活性成分之一。为探究大黄素在治疗APALI中可能的作用机理,本研究通过5%牛磺胆酸钠（Sodium Taurocholate,STC）逆行胰胆管注射法,应用SD大鼠建立APALI动物模型,利用现代生物学方法与技术,探究eCIRP在APALI发病机制中的病理潜在作用及大黄素的干预作用,以期进一步揭示APALI的发病机制并为中西医结合疗法防治APALI提供实验依据和新的治疗策略。目的:通过检测APALI大鼠模型CIRP的表达变化及拮抗CIRP对重症急性胰腺炎大鼠肺损伤的影响,以及应用重组大鼠CIRP刺激大鼠肺泡巨噬细胞并检测CIRP对该细胞的影响,以探索CIRP在APALI发病机制中的作用,同时应用大黄素进行干预性治疗的研究,探究大黄素治疗APALI的靶点,从而为治疗APALI寻找潜在靶点和应用大黄素治疗APALI提供理论依据。方法:第一部分:动物模型体内实验研究。将40只雄性SD（Sprague Dawley）大鼠,随机分为4组:假手术组（CON）,重症胰腺炎组（SAP）,C23（CIRP拮抗剂）干预组（C23）,大黄素干预组（EMO）。采用5%牛磺胆酸钠溶液（Sodium Taurocholate,STC）经胆胰管逆行注射（1ml/kg,0.1ml/min）诱导SAP大鼠模型,CON组大鼠经胆胰管逆行注入等体积无菌生理盐水。C23干预组于造模后2小时经尾静脉注入C23（8mg/kg）。大黄素干预组于术后2小时及术后12小时分别灌胃给予大黄素（40mg/kg）。造模24小时后,将各组大鼠麻醉后,开腹经腹主动脉采血,并收集胰腺及肺组织。进行HE染色观察胰腺及肺组织病理改变,并进行胰腺和肺组织病理评分来评价C23和大黄素对SAPALI的保护作用;酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定血清中CIRP、淀粉酶、IL-1β;应用全自动血气分析仪进行动脉血气分析测定;免疫组化染色观察胰腺和肺组织内CIRP表达情况及肺组织中Ly6G+细胞;采用qRT-PCR测定胰腺和肺组织中的CIRP mRNA水平及肺组织中的NLRP3、IL-1β和CXCL1的mRNA表达水平;以蛋白印迹（Western blot）法检测CIRP、p-P65、t-P65、p-IKBα、t-IKBα、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、CXCL1蛋白在各组大鼠中的表达;采用多重荧光染色观察胰岛中CIRP及肺内常驻巨噬细胞（F4/80+细胞）NLRP3和CXCL1的表达。第二部分:体外细胞学实验研究。以大鼠肺泡巨噬细胞珠NR8383细胞为研究对象,观察重组大鼠CIRP对肺泡巨噬细胞焦亡及炎症小体相关分子基因和蛋白表达的影响及大黄素的干预作用。实验一,NR8383细胞随机分为5组:对照组（Control）,重组CIRP处理组（CIRP）,TAK-242（一种TLR4受体特异性抑制剂）处理组（CIRP+TAK242）,C23处理组（CIRP+C23）,大黄素处理组（CIRP+EMO）。其中,对照组不予特殊处理,其余各组在采用重组大鼠CIRP（1.5μg/ml）处理NR8383细胞6h的同时,分别予应用TAK-242（500μM）预处理24h、应用C23（300ng/ml）预处理1h以及同时给予大黄素（20μM）干预。应用流式细胞术检测各组细胞的焦亡（Caspase-1以及PI双染）率。采用qRT-PCR测定各组细胞NLRP3、IL-1β和CXCL1的mRNA表达水平。采用Western blot法检测p-P65、t-P65、p-IKBα、t-IKBα、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、CXCL1蛋白在各组细胞中的表达。实验二,细胞分为Control组,CIRP组,CIRP+Si-IL-1β组和CIRP+NC（Negative control）组,应用NC siRNA或IL-1β特异性siRNA,在Lipofectamine 2000的介导下转染NR8383细胞48h后,用1.5μg/ml的CIRP处理CIRP组、NC组及Si-IL-1β组6h。此外,分别用不同浓度（0、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml）的重组大鼠IL-1β和应用10 ng/ml的IL-1β,以不同的时间点（0、6、12、24h）处理NR8383细胞,然后收集细胞,提取蛋白和RNA,采用q RT-PCR法和Western blot法研究IL-1β在CIRP诱导CXCl1表达中的作用。结果:第一部分,动物模型实验结果:（1）与CON组相比,SAP组大鼠胰腺及肺组织显示出明显的病理损伤,病理评分显著性增高（p<0.001）。此外,与CON组相比,SAP组大鼠血清CIRP、淀粉酶、IL-1β均明显升高（p<0.001）,且SAP组动脉血PaO2水平明显下降（p<0.001）,与此同时该组动脉血PaCO2水平明显上升（p<0.001）。与SAP组相比,C23组及EMO组胰腺及肺组织损伤明显缓解（p<0.001）,血清CIRP、淀粉酶、IL-1β均明显下降（p<0.001）,以及动脉血PaO2水平明显上升（p<0.001）而PaCO2水平明显下降（p<0.001）。（2）通过免疫组化、免疫荧光、qRT-PCR以及Western blot检测发现,与CON组相比,SAP组大鼠胰腺（主要位于胰岛）及肺组织CIRP表达明显增加（p<0.001）。与CON组相比,SAP组大鼠肺内p-P65、p-IKBα、NLRP3、ASC（Monomer,Dimer,Polymer）、Caspase-1 p20、GSDMD-N、IL-1β（pro-IL-1β以及p17）、CXCL1表达明显增高（p<0.001）,且SAP组大鼠肺组织内中性粒细胞（Ly6G+细胞）的浸润明显增加。（3）与SAP组相比,C23组及EMO组胰岛及肺组织CIRP表达明显被抑制,且伴随着肺内p-P65、p-IKBα、NLRP3、ASC（Monomer,Dimer,Polymer）、Caspase-1 p20、GSDMD-N、IL-1β（pro-IL-1β以及p17）、CXCL1表达的下降（p<0.05）及肺内Ly6G+细胞的浸润的明显减少。第二部分,体外细胞学实验结果。（1）用CIRP（1.5μg/ml）诱导了NR8383细胞内p-IKBα和p-P65及NLRP3、ASC（Monomer,Dimer,Polymer）、Caspase-1 p20、GSDMD-N、IL-1β（pro-IL-1β以及p17）蛋白的表达增高（p<0.001）,并进一步促进了NR8383细胞的焦亡（p<0.001）,同时还促进了其表达CXCL1（p<0.001）。TLR4受体抑制剂TAK-242几乎完全地抑制了CIRP所致的上述细胞效应（p<0.001）。结果表明,CIRP通过TLR4受体介导的NF-κB信号及NLRP3炎症小体的激活诱导NR8383细胞焦亡。CIRP拮抗剂C23和大黄素均显示出能够显著性抑制CIRP所致的NR8383细胞内NF-κB的活化、NLRP3炎症小体及组装与激活、细胞焦亡及CXCL1的表达,差异有统计学意义（p<0.05）。（2）CIRP对NR8383细胞表达CXCL1的影响。结果显示,与Control组相比,CIRP组的CXCL1表达明显增高（p<0.001）。而与CIRP组相比,CIRP+Si-IL-1β组的CXCL1表达水平显著性下降（p<0.001）,CIRP+NC（Negative control）组的CXCL1表达水平则无明显改变（p>0.05）。结果表明,IL-1β是CIRP促进NR8383细胞表达CXCL1的关键介质。分别用不同浓度（0、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml）的重组大鼠IL-1β和以相同浓度的IL-1β（10ng/ml）以不同的时间点（0、6、12、24h）刺激NR8383细胞,结果显示,IL-1β以剂量依赖性的方式和时间依赖性的方式促进NR8383细胞表达CXCL1。结论:（1）采用5%牛磺胆酸钠溶液经胆胰管逆行注射制备SAP肺损伤模型24h后,模型组大鼠血清淀粉酶含量的显著升高,胰腺和肺组织出现了明显的病理损伤,同时动脉血气分析结果也显示大鼠出现明显的呼吸功能障碍,表明SAP诱发肺损伤模型制备成功。（2）CIRP在APALI大鼠模型的胰岛及肺组织中表达增高,并伴有血清CIRP水平的升高。应用CIRP拮抗剂C23后,CIRP在胰岛、肺组织中表达下调且血清中CIRP水平下降,并明显缓解了ALI,提示CIRP与APALI发生发展密切相关。CIRP拮抗剂C23能抑制APALI大鼠肺组织中NF-κB的激活、NLRP3炎症小体的组装与活化、肺组织中CXCL1的表达及中性粒细胞的浸润,并缓解了SAP时的肺损伤。（3）CIRP可能通过TLR4受体介导激活大鼠肺泡巨噬细胞的NF-κB信号及NLRP3/IL-1β/CXCL1信号通路,在APALI中发挥重要作用。（4）大黄素能能显著降低APALI大鼠的血清淀粉酶、CIRP和IL-1β水平,能明显减轻SAP大鼠胰腺和肺组织的病理损伤,并能够改善肺功能,显示出对APALI具有较好的治疗作用。（5）大黄素可能通过抑制CIRP-TLR4介导的NF-κB和NLRP3/IL-1β/CXCL1信号通路减少中性粒细胞向肺内浸润从而发挥其治疗APALI的药理作用。