脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤。因有限的治疗方式和高致残、高死亡率、易复发的特点导致脑胶质瘤成为治疗最困难的肿瘤之一。在现阶段,脑胶质瘤的治疗手段获得了突飞猛进的进展,然而患者的预后并未得到明显的改善。因此,探索针对脑胶质瘤的新颖的辅助治疗策略是临床上的迫切需求。抗坏血酸是一种在临床试验中已被多次验证的癌症辅助治疗药物,在生理学浓度下发挥促氧化机制治疗癌症,且与放化疗联用的抗癌活性显著高于单独使用抗坏血酸。低温等离子体（Cold atmospheric plasma,CAP）是一种用于治疗癌症的物理设备喷射而产生的含有活性氮氧化物（Reactive Nitrogen Oxides,RNOS）的气体,可以选择性杀伤肿瘤细胞。在本次研究中,基于通过产生活性氧或降低抗氧化系统的活性,以打破癌细胞内脆弱的氧化还原平衡的抗癌疗法,将高剂量的抗坏血酸与低温等离子体激活的培养基（CAP-activated medium,PAM）联合用于治疗脑胶质瘤细胞系（U251、U87）和正常细胞系小鼠原代星形胶质细胞（Astroglia,AS）。在体外实验中,联用步骤为4m M抗坏血酸处理细胞1h后,再用CAP照射了3min或6min的完全培养基处理细胞2h。我们使用Cell Titer-Blue染色法检测细胞活力,发现经过抗坏血酸的预处理,增加了胶质瘤细胞系U251、U87对PAM的敏感性,且与正常细胞系AS相比,高剂量抗坏血酸与PAM联用选择性抑制U251、U87的细胞活力。使用药物协同效应软件Compu Syn分析得出,这种抑制作用具有协同性。使用Calcien-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒检测细胞死亡情况,进一步验证了抗坏血酸与PAM联用显著诱导U251、U87细胞死亡的现象。为了进一步探索抗坏血酸与PAM联用对U251、U87细胞的抑制作用,我们使用血球计数板测定细胞的增殖率,使用Annexin-FITC/PI双染法和流式细胞术检测细胞凋亡,再经过western blot检测与增殖、凋亡相关信号通路的变化情况加以验证。结果显示抗坏血酸与PAM联用通过抑制AKT/m TOR信号通路的活化来抑制细胞增殖,并且通过活化caspase-3,剪切PARP以诱导细胞凋亡。高剂量抗坏血酸自动氧化产生H2O2以及PAM中富含CAP产生的ROS。因此,接下来我们探索了抗坏血酸与PAM产生的ROS在联用中的作用。通过ROS探针、GSH/GSSG检测试剂盒来检测经联用处理后U251、U87细胞内ROS水平以及氧化还原稳态的变化。我们发现抗坏血酸与PAM的共处理使U251、U87细胞内ROS水平升高,且GSH/GSSG比值降低。使用H2O2检测试剂盒检测发现抗坏血酸与PAM的联用使U251、U87细胞内H2O2含量增加,且高于单独使用抗坏血酸或PAM处理后细胞内H2O2含量的总和。以上说明抗坏血酸与PAM联用显著增加了细胞内H2O2水平,促使ROS水平升高,导致自由氧基与抗氧化系统处于失衡状态,即发生氧化应激。根据U87细胞的转录组测序结果,结合q PCR和western blot,我们发现抗坏血酸的处理促进了水通道蛋白AQP3在细胞膜上的表达,从而促进了H2O2的跨膜扩散以更多地进入细胞内。我们根据测序结果,使用GO数据库将联用组所有上调的基因进行功能注释,发现上调基因在MAPK信号通路富集。在联用组所有上调的基因中随机挑选了11个基因,通过q PCR验证测序结果,发现抗坏血酸与PAM的联用上调了C-FOS、C-JUN及IL-6的m RNA水平。由于C-JUN是MAPK的一个亚家族JNK信号通路的下游蛋白,且ROS可以激活JNK/MAPK通路。我们通过western blot加以验证,发现抗坏血酸与PAM共处理激活了U251、U87细胞内的JNK信号通路这一现象。另外,加入JNK抑制剂SP600125后,抗坏血酸与PAM联用诱导的细胞死亡被部分逆转了。通过本次研究,可以得出以下结论:与正常细胞相比,抗坏血酸与PAM联合作用选择性抑制肿瘤细胞的细胞活力并诱导细胞死亡,且抑制效果具有协同性。抗坏血酸的预处理诱导肿瘤细胞中转运膜蛋白AQP3的扩表达,促进了AQP3转运H2O2进入细胞内,增加细胞内ROS,诱导氧化应激,由此实现抗坏血酸与PAM的协同抑制作用。且高剂量的抗坏血酸自动氧化产生H2O2和PAM中富含H2O2为此提供了H2O2的来源。除此之外,肿瘤细胞内ROS的增加,是活化JNK/C-JUN信号通路的重要因素,从而诱导细胞凋亡。综上所述,本项研究证实抗坏血酸与PAM联用的抗癌潜力,并期待可以为治疗脑胶质瘤提供新的思路和方法。