交感神经系统在调节生理过程的稳态中发挥重要作用,其与靶组织的相互作用决定了交感神经元的形态和电生理特性。哺乳动物的外周交感神经系统在解剖学上可以分为两类:椎前交感神经节与椎旁交感神经节。两类神经节中神经元的起源相同,但在发育的过程中不同神经节的神经元在功能和性质上存在明显的差异。椎前神经节中的神经元同时接受来自外周和中枢的突触传入,作为一个相对复杂的整合中心控制交感神经向胃肠道的脉管和肠神经系统输出信号。相反,大多数椎旁神经节虽然有一定数量的节前传入会聚,但其只是单纯的从脊髓向靶器官传递信息,并不能整合其它来源的信息。大鼠颈上交感神经节(superior cervical ganglia,SCG)是体积较大的融合神经节,位于椎旁神经链的头侧,其靶组织包括头部和颈部的脉管系统、颌下腺及虹膜。在不同哺乳动物的交感神经元中,普遍证实存在两种不同电生理类型的神经元,一种称为phasic神经元,另一种称为tonic神经元。Phasic神经元接受来自脊髓节前运动神经元发出的少数较大的阈上刺激,主要作为延迟神经元连接中枢神经系统和外周的器官;相反tonic神经元接受来自节前的脊髓神经元和外周感觉神经元发出的多数较小的阈下刺激,并整合刺激使细胞发放动作电位。在持续的去极化刺激条件下,phasic神经元与tonic神经元动作电位的发放形式不同,前者只有动作电位的短暂瞬时爆发,而后者则表现为动作电位的连续发放。交感神经元发放特性的不同与其表达的电压门控型离子通道的种类和特性有关。多个研究小组的结果提示,交感神经元动作电位的发放特性可能与“A电流”、“M电流”或“D2电流”有关。目前认为与“M电流”的关系最为密切。M电流是一种低阈值、电压和时间依赖型、慢激活、慢去活、非失活的外向钾电流。它由Brown和Adams于1980年首次在牛蛙的交感神经节中发现。介导M电流的通道称为M通道。M通道广泛分布于众多类型的组织和细胞中,其中包括交感神经节、背根神经节、海马组织、一些中枢神经细胞、NG108-15和PC12细胞系,等等。M通道是KCNQ基因编码的钾离子通道超家族中的一员,目前认为KCNQ2/KCNQ3异聚体是神经M通道的主要分子基础,KCNQ5亚单位与M通道构成的多样性有关。M通道基因改变或功能障碍与癫痫、良性家族性新生儿惊厥症(BFNCs)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’Disease)、疼痛等神经系统病变有关。M电流是唯一在阈电位附近激活的电流,它与可兴奋细胞的兴奋性密切相关。M电流在神经元向阈电位方向去极化时被缓慢激活,使细胞膜电位超极化,减少去极化,起到稳定细胞膜静息电位的作用。当M电流受到抑制后,细胞膜易发生去极化,使细胞容易爆发动作电位,进而改变细胞动作电位的发放性质和对突触传入的反应性。M电流可接受众多神经递质与激素的调节,包括:乙酰胆碱(Acetylcholine)、缓激肽(Bradykinin)、血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ)、黄体生成素释放激素(LHRH)等。它们通过激活相应的G蛋白偶联的受体(GPCR)或通过影响其下游的信号分子(PIP2、IP3、DAG、PKC等)调节M电流,进而发挥调控神经系统兴奋性的作用。除GPCR外,其他种类的受体如受体酪氨酸蛋白激酶(RTKs)类等对M通道的作用研究很少。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是神经营养因子(neurotrophin,NT)家族中最早发现的成员。除神经生长因子外,本家族还包括脑源性神经营养因子(Brain- derived Neurotrophic Factor, BDNF)、神经营养因子3(NT- 3)、神经营养因子4/5(NT-4/5)、神经营养因子6(NT-6)和神经营养因子7(NT-7)等。神经营养因子广泛存在于神经系统中并通过相应受体来调节神经元的存活、增殖、分化,神经突起的生长及重要的功能蛋白质如受体蛋白、离子通道蛋白等的表达;除此之外,神经营养因子还能调节神经元之间突触的形成和传递,神经递质的释放以及长时程增强作用等。神经生长因子的受体有两种:一是原肌凝蛋白相关受体A(Tropomyosin related kinase A, Trk A),属于受体酪氨酸蛋白激酶家族;一是泛神经营养因子受体p75NTR,即神经营养因子家族成员的共同受体,属于肿瘤坏死因子家族受体。两分子神经生长因子结合于Trk A受体,可引起受体二聚化、自我酪氨酸磷酸化而激活受体。受体激活后可活化细胞内一系列的级联反应,包括PLCγ介导的PIP2水解及产生细胞内第二信使分子、磷脂酰肌醇3激酶(PI-3 kinase)介导的磷酸酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)的生成、Ras蛋白介导的MAPK级联反应和细胞内广泛的非受体酪氨酸蛋白激酶活性等。两分子NGF结合于p75NTR可激活细胞内JNK和NF-κB信号通路介导神经元的凋亡等过程,也可激活鞘磷脂酶分解细胞膜鞘磷脂产生神经酰胺,调节细胞内一些复杂的生物过程。神经生长因子的生物学作用多是一种慢效应,依赖于对基因转录和表达的调控。但是,越来越多的证据表明,神经生长因子还表现出快速调节作用,如调节神经递质的释放,神经元突触的传递,离子通道的功能和神经元的兴奋性等。综上所述,本实验以大鼠SCG神经元为平台,观察了交感神经元兴奋性与M电流的特征,及其二者的关系。在此基础上,观察了NGF对M电流及神经元兴奋性的影响,并初步探讨了可能的分子机制;此外,我们比较了NGF与传统的M电流调节剂如M胆碱受体激动剂Oxo-M和M通道阻断剂linopirdine(LP)作用的异同和特点。目的:分离培养大鼠SCG神经元,利用膜片钳技术记录神经元动作电位和M通道电流,(1)观察SCG神经元兴奋性及M电流的特征;(2)确定神经元兴奋性及M电流的关系(3)观察NGF、Oxo-M和LP影响神经元兴奋性的特征;(4)初步探讨NGF对M通道作用的机制。方法:(1)SCG神经元的分离与培养:取4-6周龄的SD大鼠,雌雄不限,迅速摘取其颈上神经节,经过剪切、消化、洗酶、重悬、种植等过程,生化培养箱37°C,5%CO2+95%混合气,培养1d后用于膜片钳记录。2d内使用完。要求:无菌,低温,操作迅速。(2)电生理学实验:利用打孔膜片钳技术和全细胞膜片技术,记录神经元动作电位和离子通道电流,给予Oxo-M、LP、NGF等,观察这些药物对神经元兴奋性和通道电流的作用并分析其作用机制。要求:①相同条件的灌流给药和②严格有效的实验对照。结果:(1)根据在去极化电流的刺激下动作电位爆发的个数不同,大鼠SCG中存在三种具有不同电生理特征的神经元,分别为:phasic-1,只爆发一个动作电位,占36.4%;phasic-2,占53.5%,紧密爆发2~6个动作电位;tonic,持续爆发动作电位,占10.1%。说明SCG中以phasic神经元为主。以动作电位爆发的个数为主要指标,结合静息电位、爆发的潜伏期及动作电位间期、静息电位与阈电位的差值等4个方面对三类神经元进行比较,观察它们兴奋性的特点。统计数据表明:三类神经元两两间比较动作电位爆发个数均存在显著的差异(p<0.01),相同条件下tonic神经元爆发的个数最多,phasic-2次之,phasic-1最少;phasic-1和phasic-2神经元的静息电位约-55mV,与tonic神经元相比均存在显著的差异(p<0.01),后者的静息电位较高,为-49.7mV;phasic-2和tonic动作电位爆发的间期存在显著的差异(p<0.01)。说明tonic神经元的兴奋性较phasic神经元高。(2)三类神经元兴奋性对递增式注入电流的反应性不同。Phasic-1神经元在较大幅度的电流(200pA~300pA)注入时不增加其动作电位的爆发个数;phasic-2神经元在较小幅度的电流(10pA~100pA)注入时动作电位的爆发个数显著增加,发放形式由phasic转变为tonic;tonic神经元在微小幅度的电流(20pA~30pA)注入时即显著增加动作电位的爆发个数,说明phasic-2和tonic神经元对注入电流的敏感较高,反应性较好,phasic-1神经元的兴奋性状态较稳定。(3)三类神经元中M电流的大小和电生理学特征不同。以-60mV的尾电流为指标,phasic神经元与tonic神经元的M电流的大小存在显著的差异(p<0.01),后者的电流大小为33.7±3.36 pA (n=19),仅为前者的1/3,说明Tonic神经元的M电流较其它两类神经元小。Tonic神经元的I-V曲线较其它phasic神经元右移,去活和激活的时间常数也较phasic神经元显著增加(p<0.01),说明tonic神经元的M电流在较高的电压下才能被激活,去活和激活的时间较长。(4)神经元动作电位的爆发个数似乎与其M电流的大小有关,M电流较小,爆发个数则多;M电流较大,爆发个数则少,呈现一定的相关性。(5)Oxo-M和LP通过抑制M电流,可以不同程度地提高phasic和tonic神经元的兴奋性。对tonic神经元影响最为显著,phasic-2次之,phasic-1相对最不明显。这可能与药物对M电流的抑制率有关。(6)Oxo-M对phasic和tonic神经元M电流的抑制率相同,均为75%左右,说明神经元兴奋性的改变可能与其自身的兴奋状态和抑制后剩余的M电流的绝对大小有关。(7)NGF可以抑制SCG神经元的M电流,但抑制程度远小于Oxo-M和LP对M电流的抑制,且长时间冲洗M电流不能从抑制中恢复。对phasic和tonic神经元的抑制率没有差异。(8)NGF可以提高tonic神经元的兴奋性,但对phasic神经元的兴奋性没有影响。这可能与NGF对M电流的抑制率较低,抑制后phasic神经元剩余的M电流的较大,仍可以维持其原来的兴奋性状态有关。(9)在NGF抑制的基础上,用Oxo-M加强对M电流的抑制程度,可以提高phasic神经元的兴奋性,进一步说明M电流抑制程度的大小与神经元改变兴奋性关系密切。结论:(1)大鼠SCG中存在phasic-1、phasic-2和tonic三种不同电生理类型的神经元,以phasic神经元为主。(2)phasic-1、phasic-2和tonic神经元的兴奋性及对电流刺激的敏感性和反应性不同,tonic神经元最高,phasic-2神经元次之,phasic-1神经元最低。(3)phasic-1、phasic-2和tonic神经元M电流的大小和电生理学特征不同。Tonic神经元的M电流较其它两类神经元小,I-V曲线右移,需在较高的电压下才能被激活,去活和激活的时间常数均较长。(4)神经元动作电位的爆发个数与其M电流的大小呈现出一定的相关性。M电流较小,爆发个数则多,反之亦然。(5)Oxo-M和LP对phasic和tonic神经元M电流的抑制率相同,抑制M电流可以不同程度的提高两类神经元的兴奋性。(6)NGF对SCG神经元M电流的抑制率较低,在phasic和tonic神经元两者间没有差异,抑制M电流可以提高tonic神经元的兴奋性,对phasic神经元的兴奋性没有影响。抑制后剩余的M电流的大小与神经元的兴奋性状态有关。