目的:急性播散性脑脊髓炎（acute disseminated encephalomyelitis,ADEM）是儿童时期比较常见的发生在中枢神经系统中的以髓鞘脱失为主要表现的疾病,目前,确切的发病原因和机制还不完全明了,易留有永久的神经系统后遗症。在ADEM的病灶中,受累的细胞主要是少突胶质细胞,呈现不同程度的丢失。少突胶质细胞的主要功能是形成神经髓鞘,因此,髓鞘损伤的修复从根本上说是少突胶质细胞的修复。怎样将少突胶质细胞的损伤降到最低点,如何促进内源性的胶质前体细胞分化成有功能的少突胶质细胞以及通过外源性细胞移植的手段来促使中枢神经系统损伤的修复,一直是国内外学者的致力研究的热点之一。目前,临床上对于急性播散性脑脊髓炎的治疗主要采用免疫疗法,尽管收到了一些临床疗效,但不令人十分满意。近十余年来,随着神经干细胞的研究的深入,细胞移植受到了人们越来越多的重视。以往多采用胚胎神经干细胞,以及成体神经干细胞来进行,但由于受到取材困难、组织来源缺乏、移植过程中的免疫排斥反应、移植技术问题、伦理学争端及法律限制等问题导致其临床应用受限。近年来由于骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）具有来源广泛,取材容易,便于自体移植,长期体外培养过程中始终保持自我复制和多向分化的潜能,免疫原性弱,不论是通过局部还是通过静脉途径进行移植都能产生积极作用的特性,使得BM-MSCs成为人类中枢神经系统损伤修复最有前途的治疗策略之一。MSCs分布于不同的组织中并且分布极广,以骨髓中为最多。MSCs在不同的微环境下可向不同的谱系分化,如神经元、神经胶质细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞及内胚层的牙细胞等。在没有诱导因子存在的情况下,MSCs可分裂70次以后形态和表型保持不变,仍具有向多个方向分化的潜能。MSCs来源充足,易获得,易于体外扩增,不表达主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子,能够被受体很好的耐受,而且可取自自体,避免了免疫排斥反应,使得MSCs成为干细胞研究领域的热点,是一种理想的组织工程干细胞。MSCs移植对心肌损伤、软骨及骨损伤等许多领域的治疗中已经发挥了巨大的作用。在脊髓损伤、脑梗塞等神经系统疾病的实验治疗中发现实验大鼠临床症状改善,MSCs可促进轴突生长、具有神经发生的潜能并分化成神经样细胞,增强了内源性神经前体细胞的增殖和神经分化等作用。在对实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）的治疗中发现治疗组大鼠的临床症状明显改善,但具体机制不明。本实验采用ADEM经典的动物模型—实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）,在阐述正常及EAE大鼠鼠脑少突胶质细胞分布、髓鞘形成的基础上,通过体外培养骨髓间充质干细胞并经侧脑室注射的方法移植到EAE大鼠脑内,从形态、病理、少突胶质细胞谱系的变化、髓鞘转录因子以及髓鞘蛋白的表达水平的变化来阐述骨髓间充质干细胞对EAE的治疗机制。研究方法:本研究采用EAE模型,用于制备抗原的豚鼠雌雄不限,体重为180²50克;Wistar雌性大鼠,6⁸周龄,体重160¹80克。豚鼠称重,10%水合氯醛麻醉,活体状态下取全脊髓,制备匀浆+等体积完全福氏佐剂（CFA）制备抗原。Wistar大鼠称重麻醉,四个足垫分别注射已经乳化好的抗原0.1ml,并辅以左足背注射百日咳（BPV）疫苗0.1ml/只。将雄性100克左右的Wistar大鼠麻醉,在无菌的条件中取出股骨,除去骨表面的组织。利用注射器吸取含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液冲洗骨髓腔,得到细胞悬液。接种到培养瓶中,于37℃、5%CO₂环境中的培养箱培养。24小时弃去未贴壁细胞,每隔2-3天更换培养液,弃去悬浮的细胞。当细胞达到80%融合时传代。将传代3次的细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后应用流式细胞仪进行鉴定所提取的细胞是否为骨髓间充质干细胞。实验动物共218只,共分4组,分别为正常对照组、EAE组、假性治疗组、MSCs治疗组。正常对照组是指整个实验过程中不加任何刺激及干预因素,EAE组共分六个时间点,分别为造模后1d、3d、7d、14d、21d、28d,每个时间点8只Wistar大鼠。MSCs治疗组于发病当天双侧侧脑室注射MSCs,总剂量为2×10⁵/20ul,每侧各10ul,取材时间同EAE组。假性治疗组在发病当天双侧侧脑室注射等量的MSCs细胞培养液,取材时间同EAE模型组。取材时采用左心室灌注固定后4%多聚甲醛保存用于石蜡切片;左心室灌注固定后4%多聚甲醛放置24小时,20%蔗糖放置24小时后,-80℃冰箱保存用于免疫荧光;经左心室灌注生理盐水后取材,经液氮快速冷冻后置-80℃冰箱保存用于western-blot及real-time PCR测定。应用行为学评分观察大鼠临床行为改变;Bielschowsky镀银染色观察脑组织髓鞘病理变化;应用免疫荧光观察大鼠少突胶质细胞谱系的改变;Real-time PCR法检测髓鞘碱性蛋白（MBP）mRNA、髓鞘转录因子1（MyT1）mRNA的表达;Western-Blot印迹分析检测MBP、MyT1蛋白的表达。采用SPSS13.0软件包进行统计学处理。结果:1、临床行为学改变:EAE组的临床行为学评分在1d、3d、7d最高,14d时有所降低,21d、28d最低。假性治疗组与EAE组改变基本相同。MSCs治疗组临床行为学评分1d时最高,自3d起明显降低,7d时恢复正常（评分降为0）。2、髓鞘的病理改变:正常组大鼠鼠脑髓鞘结构完整;EAE组1d时髓鞘破坏较重,3d、7d时最重,14d、21d、28d较前有所恢复,但未达到正常组水平;假性治疗组髓鞘损害变化趋势与正常组相同;MSCs治疗组1d时髓鞘有较严重破坏,3d起逐渐恢复,以后各时间点均较EAE组明显改善（p<0.05）。3、少突胶质细胞谱系的变化:少突胶质细胞祖细胞（A2B5）、不成熟的少突胶质细胞（O4）可见于大脑皮层、白质和小脑,以白质最多,尤其是海马部位,成熟的少突胶质细胞（CNPase）主要见于白质,生后少突胶质前体细胞逐渐随着时间的延长而减少;EAE组1d时大鼠A2B5和O4阳性细胞数无明显变化,CNPase阳性细胞明显减少;3d和7d时A2B5、O4、CNPase阳性细胞数较1d组明显减少;EAE14d、21d、28d时A2B5、O4、CNPase阳性细胞数逐渐增多;假性治疗组变化趋势与EAE组相同（p>0.05）;MSCs治疗组1d时大鼠A2B5、O4、CNPase阳性细胞数无明显变化,3d后A2B5、O4、CNPase阳性细胞数逐渐增多,14d时达高峰。4、MBP mRNA、MyT1 mRNA表达水平的变化:EAE组1d时大鼠MBP和MyT1 mRNA表达与正常组相比无明显变化,3d和7d时MBP和MyT1 mRNA表达较1d组增多,EAE 14d、21d、28d时MBP和MyT1 mRNA表达逐渐增多;假性治疗组MBP和MyT1 mRNA表达的变化与EAE组相比无显著差异（p>0.05）;MSCs治疗组1d时大鼠MBP和MyT1 mRNA表达较EAE组增多,治疗后3d、7d、14d、21d、28d时MBP和MyT1 mRNA表达明显较前增多（p<0.05）。5、MBP和MyT1蛋白表达水平的变化:EAE组1d时大鼠MBP和MyT1蛋白表达与正常组相比无明显差异,3d和7d时MBP和MyT1蛋白表达较1d组渐增多;EAE14d、21d、28d时MBP和MyT1表达逐渐增多;假性治疗组MBP和MyT1蛋白表达与EAE组相比无显著差异（p>0.05）;MSCs治疗组1d时大鼠MBP和MyT1蛋白表达较EAE组增多;治疗3d、7d、14d、21d、28d时MBP和MyT1表达明显较前增多（p<0.05）。结论:1、正常6⁸周大鼠脑内髓鞘结构完整,较多的少突胶质前体细胞多于脑内分布,正常状态下MBP mRNA,MyT1 mRNA表达较少,MBP含量较高,MyT1表达较少;2、EAE模型制备较稳定,在EAE早期阶段脑内髓鞘破坏较重,在病程的中晚期损伤髓鞘有一定程度的恢复,脑内的少突胶质前体细胞有不同程度的增殖,分化,MyT1 mRNA,MBP mRNA表达增多,MyT1,MBP蛋白表达增多;3、骨髓间充质干细胞移植对EAE大鼠的临床行为学有显著的改善,对EAE大鼠的髓鞘损伤有显著的修复作用,骨髓间充质干细胞移植后,少突胶质前体细胞明显增多,骨髓间充质干细胞移植促进了MBP mRNA、MyT1 mRNA的表达,骨髓间充质干细胞移植促进了MBP、MyT1蛋白的表达。