团头鲂结缔组织生长因子的克隆和PB转座子、PB-Tgf2复合转座元件的构建及转基因效率研究

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:d632709901
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团头鲂(Megalobrama amblycephala)在我国淡水鱼类中有着重要的经济地位,但其属于不耐低氧的鲤科鱼类,在大规模的经济养殖中极易因为缺氧死亡,从而限制其产量的提高。发掘主效基因的功能是进行水产动物遗传育种基础研究的重要内容,而转座子在功能基因的获得和研究方面也起到了至关重要的作用,在水产动物分子育种方面有着潜在的应用前景。  结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)为高度保守的CCN多肽家族中的成员,被命名为CCN2,是一种富含半胱氨酸的分泌肽。CTGF包括了 N-末端分泌肽和四个多功能结构域,潜在影响多个信号传导机制。研究表明,CCN2与结合的一些生长因子之间的相互作用介导了 CCN2对细胞增殖、存活、分化、粘附、迁移和细胞外基质的生成产生影响。由于结缔组织生长因子含有IGFBP结构域,而IGFBP-1的内含子中发现有发现缺氧诱导因子HRE,因此推测CTGF可能也参与团头鲂缺氧应答相关分子机制。  本文获得了团头鲂Ctgfa/b重复基因cDNA的全长序列,Ctgfa和Ctgfb基因全长分别为2153bp和1467bp,开放阅读框分别为1032bp和1056bp,分别编码343个和351个氨基酸。与人类和斑马鱼一样,团头鲂成熟Ctgfa和Ctgfb多肽也包含4个区域:IGFBP、VWC、TSP_1和Cys_knot,分别包含的半胱氨酸基团数为11、10、5、11个。团头鲂Ctgfa和Ctgfb的编码区相似度为57%,团头鲂Ctgfa与人Ctgf和斑马鱼Ctgfa的相似度都分别为79%和96%,团头鲂Ctgfb与人Ctgf和斑马鱼Ctgfb的相似度都分别为56%和89%,由此可见Ctgfs在进化上具有较强的保守性。  RT-PCR分析结果表明,团头鲂Ctgfa和Ctgfb基因在不同胚胎时期具有不同的表达模式。Ctgfa在0-12hpf阶段表达量逐渐下降,从16hpf开始表达明显增加,32hpf后表达量趋于稳定;Ctgfb在0-20hpf阶段表达量都较弱,比较恒定且差异不明显,从24hpf开始,表达量逐渐增加。Ctgfb在0-40hpf胚胎时期,尤其从24hfp开始,表达量都比Ctgfa低得多。在成年团头鲂中,Ctgfa在除心脏、肝脏和性腺外的所有组织中均有表达,而Ctgfb在所有组织中均有表达,但表达量较Ctgfa要弱得多,在脑和鳃中Ctgfa和Ctgfb的表达量都是所有组织中最多的。整胚原位杂交结果显示,在团头鲂胚胎中 Ctgfa mRNA在后脑、脊索中表达,Ctgfb mRNA主要在脊索中表达,但表达量要少于Ctgfa。  本文还开展了PiggyBac转座子和PB-Tgf2复合转座系统介导的团头鲂转基因效率研究。分别构建了带有2种不同启动子的供体质粒pPBs-EF1α-eGFP和pPBs-Tgf2-RPrmP-eGFP,以及辅助质粒pCS2-PBTP,将供体质粒和转座酶mRNA共同注射到团头鲂的受精卵中。PCR显示,这两种转座系统在团头鲂成鱼基因组中的整合效率分别为为53.04%和32.14%。表明PiggyBac转座子以及PB-Tgf2转座系统可高效介导基因在团头鲂基因组中的插入,为进一步开展团头鲂插入诱变研究奠定了一定的基础。
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