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肝细胞核因子4α(HNF4α)，是肝细胞核因子家族的重要成员，为核受体型转录因子，可调控大量肝细胞特异基因的表达，是肝脏分化和功能维持的主要调控者，既往研究发现HNF4α是潜在的慢性肝病和肝癌的治疗靶点。 为了筛选可与HNF4α蛋白结合的小分子化合物，构建了原核表达质粒pET28b-SUMO-HNF4α，用于制备带有SUMO标签的SUMO-HNF4α融合蛋白。亲和层析法纯化SUMO-HNF4α蛋白，Ulp1酶去SUMO化后得到不带任何标签HNF4α重组蛋白，其浓度可达240.7μM、纯度为90％以上。利用该蛋白建立了蛋白热迁移实验方法，以曲线稳定和节省蛋白为原则选择5μM的蛋白和5×SYPROOrange染料作为体系固定条件。利用HNF4α下游基因NINJ1的启动子上HNF4α结合区(NINJ1-p)和HNF4α的同源二聚体结合DNA片段(DNA Ligand)验证该筛选系统，结果显示25μM浓度的NINJ1-p和DNA Ligand片段，分别可使HNF4α的Tm值迁移3.08℃和4.21℃。利用已确定为HNF4α抑制剂和激活剂的化合物木犀草素和阿尔维林验证该筛选体系，结果显示200μM木犀草素可使HNF4α蛋白Tm正向迁移4.85℃;而在阿尔维林浓度为400μM时，Tm的迁移可达到1.97℃，表明木犀草素和阿尔维林均可与HNF4α蛋白直接结合。由此，建立了一个基于蛋白热稳定性的筛选体系，该体系可通过挑选改变HNF4α蛋白热稳定性的化合物，以迁移度数Tm为指征，达到筛选与HNF4α体外结合的小分子化合物的目标。 为了检测小分子化合物对HNF4α转录活性的影响，构建含有九个拷贝的NINJ1-p的报告基因质粒pGL3-NINJ1-9p，并转染肝癌细胞，荧光素酶报告基因法确定该报告基因质粒可用于检测肝癌细胞内HNF4α的转录活性变化，结果显示pGL3-NINJ1-9p报告基因质粒不仅可检测内源性HNF4α活性，并且可在未过表达和过表达HNF4α的人肝癌细胞株中，检测到由木犀草素和阿尔维林引起的HNF4α转录活性的变化。因此该报告基因质粒可用于检测小分子化合物对HNF4α转录活性的调控作用。 利用所建立的小分子化合物筛选体系对一含有2558个小分子的化合物库进行了筛选，获得可与HNF4α直接结合的化合物P291-C02，报告基因实验结果显示10μM P291-C02可使肝癌细胞HepG2中HNF4α的转录活性提高3倍左右;Western blot检测显示5μM P291-C02可明显上调HepG2细胞HNF4α蛋白水平的表达;RT-PCR实验结果表明10μM P291-C02可上调HepG2细胞中HNF4α调控的下游基因mRNA的表达;CCK-8法检测发现5μMP291-C02即可抑制HepG2细胞增殖。 综上，成功建立了一个调控HNF4α活性的小分子化合物筛选体系，由以蛋白热稳定性为基础的筛选系统和以报告基因为基础的检测系统构成，可简单快速地筛选出直接与HNF4α结合并调控其转录活性或表达的小分子化合物，并且利用该体系筛选获得一个可促进其转录活性和表达的化合物P291-C02，为发现靶向HNF4α的治疗慢性肝病及肝癌的小分子化合物及药物提供方便有效的工具。