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三型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)是革兰氏阴性致病菌重要的毒力分泌系统。耶尔森氏菌T3SS由pYV或者pCD毒力质粒编码,通过针状注射体结构将毒力效应因子(Yops蛋白)分泌至宿主细胞内,达到致病目的。耶尔森氏菌Ysc-Yop T3SS装置的组装和Yops蛋白的分泌过程非常复杂,研究蛋白之间的相互作用,对深入了解装置组装过程,完善Yops分泌机制具有重要意义。本研究以假结核耶尔森氏菌为研究对象,采用细菌双杂交对pYV毒力质粒编码的T3SS相关蛋白进行全面筛选,并对筛选得到的相互作用蛋白进行系统分析。通过文献调研,选择本研究中新发现的可能对T3SS分泌过程有重要意义的相互作用蛋白进行深入研究,进一步完善对T3SS装置组装与Yops蛋白分泌过程的了解。论文主要包括以下三方面的内容:1.pYV毒力质粒上T3SS相互作用蛋白的筛选:通过细菌双杂交蓝白斑法初筛及β半乳糖苷酶活性测定复筛,共筛选到43对相互作用蛋白,其中22对已经有文献报道。21对尚未有文献报道的相互作用蛋白有12对为自身相互作用蛋白,说明这些蛋白可能以多聚体的形式发挥作用。结合文献报道,发现YscQ和YscO是T3SS正常发挥生理功能不可或缺的,但具体作用机制并不清楚,YopH与YopM的分泌过程也并不清楚,最终选择YopH-YscQ和YopM-YscO作为研究对象,探讨YscQ,YscO分别在YopH,YopM分泌过程是否发挥作用。2.YopH-YscQ和YopM-YscO相互作用验证:通过体外Pull-down确定YopH-YscQ、YopM-YscO存在相互作用;通过对YopH、YscQ、YopM、YscO蛋白结构进行分析,构建不同的截短克隆,利用细菌双杂交寻找作用区域。最终确定YopH N端对分泌转运起关键作用的1-140aa与YscQ 218aa-C具有相互作用,而yscQ编码全长YscQ及YscQc,YscQc与YscQ218aa-C序列一致,推测全长YscQ的218aa-C区域与YscQc在YopH的分泌转运过程可能发挥作用;而YopM N端与分泌转运相关的1-100aa与YscO具有相互作用,但YscO上的作用区域未能确定,YopM与YscO的相互作用可能依赖于YscO结构的完整性。3.YscQ和YscQc功能分析:体外Pull-down验证YscQc与YopH存在相互作用,YscQ、YscQc是T3SS发挥功能必需。通过寻找YscQc与YopH相互作用位点及对YopH分泌的影响,本研究首次发现YscQ和YscQc过表达对Yops分泌具有反馈抑制作用,并且这种反馈抑制可通过lcrQ的缺失得以解除,这为进一步研究YscQ/YscQc对T3SS的调控机制及LcrQ的分泌机制奠定了基础。