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目的:人巨细胞病毒(HCMV)属于β-疱疹病毒科,发达国家血清抗体阳性率可为30%～90%。人群感染HCMV通常为无症状的潜伏感染,但在免疫低下人群,如艾滋病人、晚期肿瘤患者等,可导致严重感染,甚至死亡。先天性HCMV感染常常导致新生儿多种畸形以及迟发型中枢神经系统损伤。细胞自噬是指溶酶体介导,对细胞内受损衰老的蛋白质和细胞器进行一系列的降解过程。它在维持细胞内环境稳态、抵抗病原微生物的入侵和寄生中起着重要作用。目前针对HCMV和自噬相互关系的科研工作大多建立在HCMV增殖感染基础上,对于更为普遍的HCMV潜伏感染和自噬的关系尚无相关报道。所以研究自噬与HCMV潜伏感染的相互调控关系,可以为HCMV感染的防治以及优生优育指明了未来的方向。方法:1、构建HCMV潜伏感染研究模型:5MOI的HCMV感染的人急性单核白血病细胞(human acute monocytic leukaemia cell line,THP-1),分别在 1 天、2天、3 天、5天、7天和9天时间点收集总RNA和总蛋白,RT-PCR检测UL122基因、UL138基因表达水平。western blot检测UL122蛋白(IE)、UL138蛋白表达水平。以此确定HCMV感染THP-1后进入潜伏状态的时间,从而构建稳定的HCMV潜伏感染模型。2、THP-1细胞自噬水平改变对HCMV潜伏感染的影响:以MOI为5的HCMV感染THP-1细胞,同时分别使用自噬抑制剂3-甲基丙氨酸(3-MA)、自噬促进剂雷帕霉素改变THP-1细胞的自噬水平,以无药物处理的感染HCMV的THP-1细胞作为对照组,分别在感染后第2天、第7天收集细胞提取总RNA和总蛋白。PCR检测HCMV基因拷贝数,RT-PCR检测UL122基因、UL138基因、Beclin1基因表达水平。western blot检测UL122蛋白(IE)、UL138蛋白、Beclin1蛋白、LC3剪切体蛋白表达水平。同样以MOI为5的HCMV感染THP-1细胞,感染后第5天分别利用雷帕霉素和3-MA处理THP-1细胞,以无药物处理的感染HCMV的THP-1细胞为对照组,收集第7天和第9天的总蛋白,western blot测定IE、UL138蛋白、Beclin1蛋白表达水平。结果:1、DNA电泳结果显示:所有时间点均能检测到UL138基因,感染第3天能检测到UL122基因,而第5天后无法检测到UL122基因。western blot结果:所有时间点均能检测到UL138蛋白,感染第3天能检测到IE,而第5天之后无法检测到IE。表明HCMV感染THP-1细胞后,第5天进入潜伏感染状态,成功建立潜伏感染模型。2、THP-1细胞自噬水平改变对HCMV潜伏感染的影响(1)对HCMV潜伏感染早期建立的影响①mRNA检测结果:雷帕霉素提高了THP-1细胞中Beclin1的mRNA水平,3-MA抑制了 Beclin1的mRNA水平。雷帕霉素和3-MA改变THP-1细胞自噬水平后,对HCMV的UL122和UL138表达水平与对照组相比无差别。②western blot检测结果:雷帕霉素增加THP-1细胞中Beclin1蛋白表达水平,3-MA减少Beclin1蛋白表达水平。雷帕霉素和3-MA改变THP-1细胞自噬水平后,对HCMV的IE蛋白和UL138蛋白水平与对照组无差别。③HCMV基因拷贝数:3组不同处理的THP-1细胞中,HCMV基因拷贝数变化趋势一致,HCMV基因拷贝数先升高后下降。结果显示改变THP-1细胞的自噬水平,对HCMV进入潜伏感染无影响。(2)对HCMV潜伏感染后期维持的影响①western blot检测结果:显示雷帕霉素增加Beclin1蛋白水平,3-MA减少Beclin1蛋白水平。所有时间点均能检测到UL138蛋白,均未检测到IE蛋白。表明HCMV感染THP-1细胞建立潜伏感染后,改变THP-1细胞的自噬水平,对HCMV的潜伏状态的维持无影响。结论:1、将HCMV以MOI为5感染的THP-1细胞后,第5天进入潜伏感染状态,成功建立潜伏感染模型。2、THP-1细胞自噬水平的改变,对HCMV感染THP-1细胞潜伏感染的早期建立和后期维持都没有影响。