桑椹菌核病是危害桑椹最为严重的真菌病害之一,其病原菌在桑树开花期专一性侵染桑树花器官。桑椹缩小性菌核病是桑椹菌核病的一种,由核地杖菌(Scleromitrula shiraiana)侵染引起。本研究从桑椹菌核病发病区采集病原菌子囊壳、病果及菌核作为分离材料,最终分离到核地杖菌,鉴定出其在侵染过程中产生的黑色物质为多聚二羟萘类(DHN)黑色素。DHN黑色素不仅对病原菌在逆境中的生存起到不可估量的作用,而且与植物病原菌的致病性密切相关。DHN黑色素的生物合成由多个基因控制,任何一个基因缺失都将阻碍DHN黑色素的生物合成,进而影响病原菌的致病性。小柱孢酮脱水酶(SCD)为DHN黑色素合成途径中的关键酶。在本研究中,根据基因保守结构设计兼并引物和利用RACE技术获得ShSCD基因完整的CDS序列,采用基因敲除技术,获得ShSCD基因敲除菌株,证实了ShSCD基因在黑色素生物合成途径中的重要性。主要实验结果如下:1.ShSCD基因的克隆与信息分析根据其他已知植物病原真菌的小柱孢酮脱水酶基因的保守结构设计兼并引物并利用RACE技术,获得1083bp的全长基因组序列。该基因由2个内含子和3个外显子组成且含有保守的催化及底物结合位点。进化分析表明ShSCD与Botryotinia cinerea T4、Sclerotinia sclerotiorum的SCD基因亲缘关系最近。蛋白质二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成,三级结构与稻瘟病菌SCD蛋白的晶体结构相似。2.ShSCD敲除突变体的获得利用Genome Walking技术,分别获得ShSCD上游片段I(870bp)和下游片段II(866bp)。以PSKH为敲除载体,以潮霉素基因为筛选基因,构建敲除载体PSKH-ShSCD,经转化和筛选共得到7个转化子。PCR验证表明在转化子中未扩增到ShSCD基因,但扩增到与敲除载体相同的部分序列。半定量PCR及qRT-PCR都未在转化子中检测到ShSCD基因的表达。Southern blotting检测结果表明在野生型菌株中ShSCD为单拷贝基因且在转化子中未检测到ShSCD基因,但检测到潮霉素基因片段。表明筛选得到的转化子为阳性突变体。3.ShSCD基因的功能验证观察菌落形态发现,野生型菌株菌落正面为灰白色,背面为墨绿色,ΔShSCD突变体正面为浅黄色,背面为褐色,其他形态与野生型菌株一致。ΔShSCD突变体比野生型菌株生长较慢。测定菌株黑色素的含量,结果表示ΔShSCD突变体中黑色素的含量显著低于野生型菌株。经高盐处理后ΔShSCD突变体生长比未处理前生长较快,但与相同处理后的野生型菌株生长无显著差异。在浓度为0.5M时野生型菌株生长受到抑制,在0.9M高盐浓度时ΔShSCD突变体生长受到抑制,说明ΔShSCD突变体的渗透调节能力强于野生型菌株,受盐胁迫影响较小。经5mM H2O2处理,野生型菌株与ΔShSCD突变体的抑制率无显著差异。浓度为10mM H2O2时,野生型菌株的抑制率为89%,而ΔShSCD突变体菌株完全不生长。说明野生型菌株的抗氧胁迫能力强于ΔShSCD突变体。以上结果表明,ShSCD基因不仅对黑色素的生物合成,而且在菌丝生长、渗透调节及抗氧化方面具有重要作用。这为进一步研究桑椹缩小性菌核病的致病机理提供了理论依据,为新型杀真菌剂的研制提供了一条新的思路。