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目的：近年来非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）发病逐渐增多。其广泛因素参与的病理机制迄今尚未完全阐明。脂质代谢异常被认为是最关键和基础的环节之一，脂质代谢异常和其他多种原因诱导枯否氏细胞（KupfferCell，KC）激活释放炎症递质是脂肪肝到NASH的重要阶段。本课题将就这两方面作深入研究。目前对NASH防治尚无理想药物，中医药具有一定的优势。导师张赤志教授临床应用滋补肝肾、清热利湿的杞蓟制剂（枸杞子、水飞蓟宾组成）治疗NASH取得良好疗效。本课题采用国内外公认的动物模型，用病理学、生物化学、分子生物学技术，探讨NASH状态下脂质代谢紊乱和炎性反应情况，阐明NASH发病机理及杞蓟制剂多靶位防治NASH的作用机制，为临床应用该制剂防治NASH提供科学依据，为新药开发打下基础。方法：实验分三部分进行第一部分非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型建立及杞蓟制剂对其血清生化和肝组织病理的影响清洁级SD大鼠40只随机分为4组，每组10只：正常对照组、空白模型组、杞蓟制剂防治组、复方蛋氨酸胆碱片对照组。采用高脂饮食（普通饲料加10％猪油、2％胆固醇）复制大鼠NASH模型。用Olympus Au560全自动生化分析仪检测各组大鼠血清甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TCH）低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）和丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平，肝组织HE染色，光学显微镜下评估肝组织脂肪变性和炎症活动程度。第二部分杞蓟制剂对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏脂质代谢调控的影响（实验1-4）采用高脂饮食复制大鼠NASH模型。大鼠随机分为正常对照组、空白模型组、杞蓟制剂防治组、复方蛋氨酸胆碱片对照组。各组大鼠肝组织游离脂肪酸（freefatty acids，FFA）水平按试剂盒操作在全自动生化分析仪上测定，羟胺法检测各组大鼠肝组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、硫代巴比妥酸法检测肝组织丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。原位杂交技术检测各组大鼠肝组织过氧化物酶体增殖物激活受体a（peroxisome proliferator activatedreceptor a，PPARa）mRNA的表达。原位杂交和Western免疫印迹（Western blot）技术检测各组大鼠肝组织肝型脂肪酸结合蛋白（liver fatty acid binding protein，L-FABP）mRNA和蛋白的表达。第三部分杞蓟制剂对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏炎性反应的影响（实验1-2）采用高脂饮食复制大鼠NASH模型。大鼠随机分为正常对照组、空白模型组、杞蓟制剂防治组、复方蛋氨酸胆碱片对照组。免疫组化方法观察各组大鼠肝组织内毒素结合受体CD14、溶菌酶蛋白的表达了解KC的变化。免疫组化方法观察各组大鼠肝组织炎症介质细胞间粘附因子-1（intercellular adhesionmolecule-1，ICAM-1）蛋白的表达。结果：第一部分非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型建立及杞蓟制剂对其血清生化和肝组织病理的影响大鼠NASH模型成功建立。与空白模型组相比，复方蛋氨酸胆碱片对高脂饮食诱导的NASH大鼠具有降低TG、TCH、LDL作用（P＜0.01或P＜0.05），其对肝组织脂肪变性和炎症活动程度无明显改善（P＞0.05）；杞蓟制剂防治组血清TG、TCH、LDL、ALT、AST明显降低（P＜0.01或P＜0.05），作用均优于复方蛋氩酸胆碱片对照组（P＜0.05）；杞蓟制剂防治组肝组织脂肪变性和炎症活动程度明显改善（P＜0.01或P＜0.05），其炎症活动程度较复方蛋氨酸胆碱片对照组明显减轻（P＜0.05）。第二部分杞蓟制剂对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏脂质代谢调控的影响（实验1-4）1．与正常组相比，空白模型组大鼠肝组织FFA明显升高（P＜0.01）；与空白模型组相比，杞蓟制剂可以显著降低FFA含量（P＜0.01），作用优于复方蛋氨酸胆碱片（P＜0.01）。2．与正常组相比，空白模型组大鼠肝组织SOD活性明显下降，MDA含量明显升高（P＜0.01）；与空白模型组相比，杞蓟制剂和复方蛋氨酸胆碱片能提高NASH大鼠肝组织SOD活性（P＜0.01），降低MDA含量（P＜0.01或P＜0.05），杞蓟制剂作用优于复方蛋氨酸胆碱片（P＜0.01或P＜0.05）。3．与正常组相比，空白模型组大鼠肝组织PPARa mRNA表达明显减弱（P＜0.01）；与空白模型组相比，杞蓟制剂防治组和复方蛋氨酸胆碱片对照组大鼠肝组织PPARa mRNA表达明显增强（P＜0.05），杞蓟制剂防治组和复方蛋氨酸胆碱片对照组之间没有显著性差异（P＞0.05）。4．与正常组相比，空白模型组大鼠肝组织L-FABP mRNA和蛋白表达明显增强（P＜0.01）；与空白模型组相比，杞蓟制剂防治组和复方蛋氨酸胆碱片对照组大鼠肝组织L-FABP mRNA和蛋白表达减弱（P＜0.01），杞蓟制剂作用优于复方蛋氨酸胆碱片（P＜0.01或P＜0.05）。第三部分杞蓟制剂对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏炎性反应的影响（实验1-2）1．与正常组相比，NASH模型大鼠肝组织CD14、溶菌酶蛋白表达明显上调（P＜0.01）；与空白模型组相比，杞蓟制剂防治组大鼠肝组织CD14、溶菌酶蛋白表达显著降低（P＜0.01），优于复方蛋氨酸胆碱片对照组（P＜0.01）。2．与正常组相比，NASH模型大鼠肝组织ICAM-1蛋白表达明显增强（P＜0.01）；与空白模型组相比，杞蓟制剂能抑制大鼠肝组织ICAM-1蛋白表达（P＜0.01），作用优于复方蛋氨酸胆碱片对照组（P＜0.01）。结论：1．动物模型的复制本实验用高脂饮食复制大鼠NASH动物模型，模型组大鼠血脂增高，肝功能损害，肝组织改变符合NASH病理变化，模型复制率为100％。2．病理机制的研究2．1 NASH大鼠肝脏脂质代谢紊乱：NASH大鼠肝脏FFA增高，肝脏脂质过氧化增强，PPARa mRNA表达减弱，L-FABP蛋白和mRNA表达增强，导致脂质代谢紊乱和肝损伤，是NASH的发病机制。2．2 NASH大鼠的肝脏炎性反应：NASH大鼠肝脏内毒素结合受体CD14表达增强，KC激活，导致炎症介质ICAM-1表达增强，其综合作用是NASH发生发展的原因之一。3．杞蓟制剂对NASH的防治作用及机理杞蓟制剂能降低血清脂质、改善肝功能、改善肝组织脂肪变性和炎症活动程度，具有多靶位防治NASH的作用，作用优于复方蛋氨酸胆碱片。具体作用机理如下。3．1杞蓟制剂对NASH大鼠肝脏脂质代谢的调控：杞蓟制剂降低肝组织游离脂肪酸水平，从而减少FFA的肝脏毒性和TG积聚；提高肝组织抗氧化能力，缓解氧化应激，减少脂质过氧化；增强肝组织PPARa mRNA表达；减少肝组织L-FABPmRNA和蛋白表达。杞蓟制剂防治NASH的作用机理与纠正脂质代谢紊乱有关。3．2杞蓟制剂对NASH大鼠肝脏炎性反应的影响：杞蓟制剂通过抑制肝脏内毒素结合受体CD14和KC表达，抑制肝脏炎症介质ICAM-1蛋白表达达到防治NASH的作用。