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目的：
1.建立由正常人经G-CSF动员后外周血单采物单个核细胞(G-PBMCs)在α-GalCer诱导下进行体外扩增Vα24<+>NKT细胞的方法；检测Vα24<+>NKT细胞的免疫表型及细胞因子IL-4、IFN-γ的分泌情况；建立纯化Vα24<+>NKT细胞的方法及检测相关表型；
2.探讨Vα24<+>NKT细胞在人外周造血干细胞-NOD/SCID小鼠异种移植中的作用；
3.初步观察Vα24<+>NKT细胞在临床异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)中的作用。
方法：
1.经Ficoll液分离获得正常人G-PBMCs，在含抗原α-GalCer及细胞因子IL-2、IL-15的体系中，体外扩增培养Vα24<+>NKT细胞，采用间标磁选纯化NKT细胞；流式细胞术(FCM)检测Vα24<+>NKT细胞表面标记、扩增前后NKT细胞含量、磁选NKT细胞纯度；酶联免疫吸附试验(ELISA)测定扩增体系中IL-4、IFN-γ浓度；
2.NOD/SCID小鼠体内实验：亚致死量照射小鼠，输注人G-PBMCs，实验组同时输注NKT细胞，观察植入指标和GVHD指标。6～8周后处死小鼠，取骨髓细胞、脾脏细胞检测人CD45抗原表达；行皮肤、肝脏、脾脏、小肠病理组织学及免疫组化检查。
3.检测16例allo-HSCT患者移植物中NKT细胞含量，研究输注细胞数与移植物抗宿主病(GVHD)发生的关系。
结果：
1.Vγ24<+>NKT细胞扩增前占淋巴细胞、G-PBMC的比例及扩增12天时含量分别为（0.26±0.21)％、(0.09+0.07)％、(22.13±21.71)％，NKT细胞扩增了584.03(20·73～20372.92)倍；磁选NKT细胞纯度为86.07(60.91～92.14)％；扩增前后NKT细胞表达CD4、CD8、DN、CD56、CD161情况无显著性差异(P>0.05)，以DN亚型为主，同时表达CD56、CD161；培养第9天和12天IL-4/IFN-γ浓度比值分别为 0.0531±0.1081、0.0376±0.1148(P<0.05)。
2.建立人外周造血干细胞-NOD/SCID小鼠异种移植模型，不予照射的小鼠经尾静脉注射(Ⅳ)3×10<7>G-PBMCs可以植活，小鼠骨髓细胞人CD45表达率3.18％；照射295cGy、IV或经腹腔注射(IP)(2～3)×10<7>G-PBMCs的小鼠移植效率高，骨髓及脾脏细胞人CD45表达率分别为(24.19±20.15)％、(26.44±14.25)％，GVHD表现明显。对照组发生GVHD，实验组无明显GVHD表现。
3.16例血液病患者均进行allo-HSCT治疗并检测其输注NKT细胞数。16例均获造血重建，其中13例患者发生急性GVHD(aGVHD)，包括Ⅰ度8例、Ⅱ度1例、Ⅲ～W度4例；8例患者发生慢性GVHD(cGVHD)，其中广泛型2例，局限型6例；7例患者同时出现aGVHD及cGVHD。aGVHD发生组和无aGVHD发生组NKT细胞输注数分别为2.16(0.43～8.82)×10<6>kg、1.43(0.3～15.12)x10<6>/kg(P=0.800)；0～Ⅰ度和Ⅱ～Ⅳ度aGVHD组NKT细胞输注数分别为2.16(0.3～15.12)×10<6>/kg、1.99(0.43～8.82)×10<6>/kg(P=0.827)；cGVHD发生组和无cGVHD发生组输注NKT细胞数分别为2.07(0.3～3.05)×10<6>/kg、2.21(0.43～15.12)×10<6>/kg(P=0.798)。
结论：
1.G-PBMCs在α-GalCer、IL-2、IL-15诱导下可以短期有效扩增Va24<+>NKT细胞，以DN亚型为主，表达CD56、CD161，同时分泌大量IFN-γ。
2. 照射剂量、移植方式、移植细胞数对人-NOD/SCID小鼠异种移植GVHD模型的构建均有影响，照射295cGy、经IV(2～3)×10<7>G-PBMCs/只或IP(1～2)×10<7>G-PBMCs/RN达到要求。移植人NKT细胞可以抑制异种移植GVHD。
3.输注NKT细胞数不影响aGVHD发生、aGVHD严重程度及cGVHD发生。