空山甲标本、甲片的DNA提取及mtDNA分子鉴定标记研究

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虽然穿山甲保护的重视度不断提高,但我国走私野生穿山甲的犯罪数量却仍逐年攀升,每年森林公安及海关都会查获大量走私的穿山甲活体、肉块或其产品(皮张、甲片等)。对于查获的残缺个体和甲片,从形态学层次上进行具体穿山甲物种的鉴定存在鉴定不准确等问题,从而给司法定罪和确定国际间非法走私贸易趋向带来了困难。本文针对这一问题,从DNA水平上设计和建立了非法贸易常见3种穿山甲(中华穿山甲、马来穿山甲和长尾穿山甲)的识别方法体系。利用线粒体DNA分子标记技术研究了3种穿山甲mtDNA部分基因序列并进行了比较分析,在分子水平上获得了各自的分子鉴定标记。主要结论如下:   1.在样品的预处理、消化、提取后纯化等方面对传统提取方法进行了改进,成功地从穿山甲类动物剥制标本、干皮标本及甲片中提取DNA,然后分别用4种线粒体基因及核基因引物进行了PCR扩增验证。在分子水平上建立了对穿山甲样品无损伤性的研究方法,至此,本文的方法可以适用于多种穿山甲类查获样品的鉴定。   2.采用PCR方法扩增穿山甲样品线粒体COI区域,对测定序列进行分析比对,用MEGA4.0软件构建系统树,鉴定样本种类。结果显示,3个物种间碱基差异率由种内到种间呈逐渐增大的趋势,种间平均遗传距离远远大于种内平均遗传距离,大约为15倍;个体的聚类分析结果与形态学分类结果相同,NJ树和MP树均显示较高的置信度。可以推断出利用COI基因序列作为DNA条形码能够有效地对3种穿山甲进行物种识别。   3.经过对来自GenBank及本研究中得到的3种穿山甲的Cytb基因全序列的比较,用通用引物L14724和H15149作为模板的质量控制,设计了2组种特异引物,运用种特异引物混合PCR技术来鉴定3种穿山甲。实验结果证明此识别方法体系基本达到了稳定、高效、灵敏、重复性好的水平。
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