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背景:巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)属于β疱疹病毒亚科,在人群中感染普遍。儿童CMV活动性感染以婴儿期多见,常表现为黄疸、肝炎、肺炎、脑炎、血小板减少性紫癜等单个或多个器官功能损害。宫内先天性CMV感染90％以上出生时并无临床症状,仅5％～10％表现为症状性感染。机体受到病毒感染后是否发病及发病的严重程度与机体的免疫功能密切相关。研究发现,机体体液免疫不能有效的杀灭细胞内CMV,若机体细胞免疫处于Th1细胞优势应对状态,将有利于抑制细胞内CMV复制,Th1细胞因子也可通过活化巨噬细胞、杀伤性T细胞等效应细胞,杀伤感染的靶细胞从而清除病毒。
白介素12(Interleukin-12,IL-12)是相对分子质量为70kD的异源二聚体细胞因子,主要由活化巨噬细胞和树突状细胞(Dendritic cells,DC)产生,由40kD(p40)和35kD(p35)两个亚基组成。编码这两条链的基因(IL-12B与IL-12A)位于不同染色体上,各自有不同的调节机制。IL-12最主要的生物学特性是与共刺激分子协同作用,调节Th细胞亚群的平衡。rs3212227位点位于IL-12p40的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR),是近年来研究IL-12p40与疾病发生、发展相关性的关键性位点之一。已有研究发现,该位点的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)与儿童非变应性哮喘、Ⅰ型糖尿病、银屑病、呼吸道合胞病毒感染-丙型肝炎病毒感染等密切相关,其A/C碱基置换可能影响IL-12p40 mRNA表达,或是影响IL-12p40 mRNA的稳定性,进而影响IL-12p40和IL-12p70的表达量。
目的:本研究通过测定CMV肝炎患儿IL-12p403’UTR rs3212227位点的SNP及血浆IL-12p40水平,探讨rs3212227位点的SNP对IL-12p40表达水平的影响以及其与婴儿巨细胞病毒肝炎的相关性。
研究方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,测105例健康儿童及122例CMV肝炎患儿IL-12p403’UTR rs3212227位点SNP；采用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)测定上述儿童血浆IL-12p40水平,并对其中86例CMV肝炎患儿进行治疗跟踪,更昔洛韦抗病毒治疗3周后根据治疗效果分为有效组和无效组,并再次采血测定血浆IL-12p40水平；用SPSS13.O软件包进行数据统计处理,观察IL-12p40 rs3212227位点基因型分布频率及血浆IL-12p40水平在不同组别之间的差异性以及他们与CMV肝炎患儿血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性、尿液HCMV DNA载量等参数的相关性。
结果：
1.IL-12p40 rs3212227位点的基因型在两组对象中的分布符合Hardy-Weinberg平衡。CMV肝炎组与对照组性别、年龄分布无显著性差异。
2.CMV肝炎组IL-12p40 rs3212227位点AA、AC、CC基因型分布频率分别为34.4％、41.8％、23.8％,正常对照组分别为47.6％、40.0％、12.4％,两组基因型分布频率有显著性差异(x2=6.425,P=0.040)。两组间AA基因型和非AA基因型(包括AC和CC)之间频率分布差异显著(x2=4.0757,P=0.044,ORAA=0.578,95％CI:0.338-0.986)；两组间CC基因型和非CC基因型(包括AA和AC)之间频率分布差异也有显著性(x2=4.855,P:0.0280,ORcc=2.207,95％CI:1.080-4.510)。
3.CMV肝炎组IL-12p40 rs3212227位点等位基因A、C分布频率分别55.3％、44.7％,对照组分别为67.6％、32.4％,两组等位基因频率比较差异有显著性(X2=7.168,P=0.007；ORA=0.593,95％CI:0.404-0.871；ORc=1.686,95％CI:1.149-2.475)。
4.CMV肝炎组血浆IL-12p40水平(pg/ml)(M=536.5,P5=123.5,P95=1061.1)低于正常对照组(M=632.2,P5=226.7,P95=1829.3),经检验差异有显著性(Z=-2.721,P<0.01)。
5.CMV肝炎组IL-12p40 rs3212227位点为AA、AC、CC基因型的患儿血浆IL-12p40水平(pg/ml)分别为(M=599.7,P5=197.2,P95=1375.1)、(M=570.3,P5=124.8,P95=1192.2)、(M=512.0,P5=85:2,P95=702.5),经检验差异有显著性(H=7.385,P=0.025),其中CC基因型患儿血浆IL-12p40水平明显低于AA基因型患儿(Z=-2.715,P=0.007)。对照组IL-12p40 rs3212227位点不同基因型的儿童之间血浆IL-12p40水平(pg/ml)差异没有显著性(H=3.877,P:0.144)。
6.CMV肝炎患儿血浆IL-12p40水平与其ALT活性呈显著负相关(r=-0.433,P<0.01)。在CMV肝炎组及对照组,IL-12p40 rs3212227位点不同基因型儿童之间的血清ALT活性均没有显著性差异(均P>0.05)。
7.122例CMV肝炎患儿中,有113例尿液HCMV DNA定量阳性(>5.0×102/ml),经直线相关分析,血浆IL-12p40水平与尿液HCMV DNA载量的对数转化值(拷贝/ml,lg)呈显著负相关(r=-0.491,P<0.01)。经方差分析,IL-12p40rs3212227位点不同基因型患儿之间尿HCMV DNA载量(拷贝/ml,lg)有显著性差异,其中AA基因型患儿尿HCMV DNA载量较低,而CC基因型患儿尿HCMVDNA载量较高。
8.治疗有效组和治疗无效组IL-12p40 rs3212227位点基因型及等位基因分布频率均无显著性差异(均P>0.05)。治疗有效组患儿治疗后血浆IL-12p40水平与治疗之前相比明显升高,经检验差异有显著性(Z=-5.004,P<0.01)。进一步分析发现,其中携带IL-12p40 rs3212227AA基因型的患儿IL-12p40水平增加最明显(Z=-2.915,P=0.004),AC型患儿次之(Z=-2.032,P=0.033),而CC型患儿变化没有显著性(Z=-1.410,P=0.152)。治疗无效的患儿治疗前后血浆IL-12p40水平差异无显著性(Z=-1.449,P>0.05)。
结论：
1.CMV肝炎患儿血浆IL-12p40水平明显低于正常儿童,提示可能存在细胞免疫功能低下。
2.IL-12p40 rs3212227位点SNP与婴儿CMV肝炎的发生有关联,其中携带CC基因型及C等位基因儿童更易发生CMV肝炎,而AA基因型及A等位基因对婴儿CMV肝炎有一定保护作用。
3.CMV肝炎患儿IL-12p40 rs3212227基因多态性与IL-12p40表达量有关,其中CC基因型患儿IL-12p40表达量较低,这可能是导致其容易发生CMV感染的因为之一。
4.CMV肝炎患儿血浆IL-12p40水平与血ALT活性呈负相关,但rs3212227位点SNP与血清ALT活性无明显关联。
5.CMV肝炎患儿血浆IL-12p40水平与尿液HCMV DNA载量(拷贝/ml,lg)呈显著负相关。rs3212227位点SNP与尿液病毒载量有关联,其中CC基因型患儿尿HCMV DNA载量最高。
6.有效治疗后的CMV肝炎患儿其血浆IL-12p40水平较治疗之前明显增加。其中rs3212227位点AA基因型患儿增加最明显,这可能有利于其体内CMV的清除,而CC基因型患儿治疗后IL-12p40水平无明显改变,可能会影响病情的恢复。