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目的脱细胞同种异体气管基质是目前组织工程气管研究领域的发展方向。与传统气管替代物去抗原处理方法如化学固定法、深低温冷藏法和低压冻干法相比,去污剂-酶联合法在去除气管抗原及保留基质生物力学性能方面更有优势。气管基质经脱细胞处理后,具有以下特点：(1)气管基质的免疫原性消失或显著下降,不会引起免疫排斥反应；(2)能够较好地保留其生物力学性能；(3)支持上皮细胞、软骨细胞、骨髓间充质干细胞和单个核细胞的生长、增殖和分化。应用脱氧胆酸钠联合酶获得低免疫原性的脱细胞气管基质,所需时间长,操作繁琐,大大增加了基质感染的风险。本课题通过研究不同浓度的TritonX-100(1%、2%、3%、4%)联合核酸酶进行脱细胞处理,以及对脱细胞气管基质进行形态特征及生物力学分析和生物相容性评价,遴选出最佳TritonX-100浓度,为体外构建脱细胞同种异体组织工程气管提供实验依据和技术可行性。方法1.脱细胞气管基质制备、形态学分析与生物力学检测。1.1兔脱细胞气管基质制备：新鲜未做任何处理的气管作为对照组,实验组采用不同浓度TritonX-100(1%、2%、3%、4%)联合核酸酶脱细胞法。A组、B组、C组、D组和E组分别代表对照组,1%、2%、3%、4%Triton脱细胞组。1.2形态学分析：(1)HE染色；(2)DAPI染色；(3)软骨细胞核计数；(4)DNA含量测定；(5)扫描电镜观察气管内外表面。1.3生物力学：(1)气管力学大体形态；(2)生物力学检测。2.脱细胞气管基质生物相容性评价。2.1脱细胞气管基质植入大鼠体内,新鲜气管植入组作为对照组,2%TritonX-100联合核酸酶处理的气管作为实验组。手术操作过程：①麻醉；②备皮；③消毒铺单；④切开皮肤及皮下组织；⑤植入；⑥缝合。2.2肉眼及HE染色观察气管基质的生物相容性。结果1.气管形态学及生物力学检测结果1.1气管大体观察：A组气管呈淡红色,B组、C组、D组和E组气管基质呈白色,各组气管形态、大小相似,呈管状。1.2HE染色：A组可见大量的气管黏膜上皮细胞和软骨细胞,B组、C组、D组和E组气管上皮细胞消失,软骨细胞随着TritonX-100浓度增加而逐渐减少。A组软骨细胞壁完整,B组软骨细胞壁部分完整,C组、D组和E组软骨细胞壁基本被破坏。1.3DAPI染色：A组气管可见气管上皮细胞及软骨细胞区域呈大量的蓝色荧光,B组、C组、D组和E组气管上皮细胞区域蓝色荧光消失,软骨细胞蓝色荧光区域随着TritonX-100浓度增加而减少。1.4软骨细胞核计数：A组、B组、C组、D组和E组的气管软骨细胞核数分别为89±7、74±7、46±6、40±5和32±5。B组、C组、D组和E组与A组比较有统计学意义(P<0.05)。实验组中软骨细胞核数目随着TritonX-100浓度增加而逐渐减少。1.5DNA含量测定：A组、B组、C组、D组和E组的DNA含量分别为688.71±52.30、477.64±90.78、185.66±58.14、155.74±37.82和139.24±45.85。B组、C组、D组和E组与A组比较有统计学意义(P<0.05)。实验组中DNA含量随着TritonX-100浓度增加而逐渐减少。1.6扫描电镜：A组气管内表面可见大量的气管黏膜上皮细胞,表面铺有纤毛,排列较为规则。B组和C组气管内表面呈沟槽状分布,气管上皮细胞消失,基底膜未破裂。D组和E组气管内表面气管上皮细胞消失,局部气管基底膜破裂。A组气管外表面纤维组织致密,B组、C组、D组和E组气管外表面纤维组织较为疏松。1.7气管力学大体形态：A组、B组、C组、D组和E组气管长度分别为5.05±0.129、5.02±0.168、4.97±0.106、5.03±0.115和4.98±0.112,各组之间无统计学意义(P>0.05)。A组、B组、C组、D组和E组气管横截面横径分别为0.72±0.056、0.710±0.073、0.71±0.079、0.72±0.069和0.67±0.033,各组之间无统计学意义(P>0.05)。A组、B组、C组、D组和E组气管横截面纵径分别为0.61±0.072、0.61±0.095、0.60±0.071、0.58±0.058和0.62±0.053,各组之间无统计学意义(P>0.05)。A组、B组、C组、D组和E组气管厚度分别为0.63±0.051、0.58±0.034、0.58±0.024、0.57±0.023和0.53±0.015,D、E组与A组比较有统计学意义(P<0.05)。1.8生物力学：A组、B组、C组、D组和E组气管最大应力分别为0.675±0.126、0.677±0.145、0.628±0.105、0.567±0.085和0.482±0.115,只有E组与A组比较有统计学意义(P<0.05)。A组、B组、C组、D组和E组气管弹性模量分别为2.418±0.524、2.282±0.434、2.155±0.428、2.153±0.375和1.44±0.231,只有E组与A组比较有统计学意义(P<0.05)。2.脱细胞气管基质生物相容性评价。2.1肉眼观察：对照组气管基质降解明显,局部有炎症反应,实验组气管基质软骨基本存在,生物相容性较好。2.2HE染色：对照组可见气管基质基本消失,基质周围较多炎性细胞浸润。实验组气管基质较完整,炎性细胞浸润较少。结论1.本课题采用不同浓度的TritonX-100(1%、2%、3%、4%)联合核酸酶进行脱细胞处理,采用HE染色、DAPI染色、软骨细胞计数、DNA含量测定、扫描电镜及生物力学进行检测,结果显示2%TritonX-100处理的脱细胞气管基质在形态学及生物力学方面具有明显优势。2.2%TritonX-100处理的脱细胞气管植入大鼠体内,基质无明显降解,生物相容性良好,适合组织工程气管的构建。