茶树菇β-葡萄糖苷酶的分离纯化及应用

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β-葡萄糖苷酶是一类在生物体内催化水解β-D-葡糖苷非还原性末端的β-D-糖苷键的酶,生成葡萄糖和糖苷配基,葡萄糖可作为一种重要的微生物发酵的碳源,不同的糖苷配基多为生物活性分子。本实验利用茶树菇子实体作为β-葡萄糖苷酶提取的生物材料,子实体匀浆、离心后的粗酶液经超滤、硫酸铵分级沉淀、制备电泳纯化,得到电泳纯的β-葡萄糖昔酶。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明β-葡萄糖苷酶的相对分子质量为26kDa。利用超滤、阴离子交换层析的分离手段大量提取纯化β-葡萄糖苷酶,其纯化倍数为3.04,酶活回收率为28%。  温度、pH、抑制剂、激活剂、底物浓度都会对酶促反应速率产生重要的影响。研究结果表明,β-葡萄糖苷酶的最适反应温度及pH分别为50℃和6.0。β-葡萄糖苷酶在最适反应条件下贮存3h后,酶活仍保留60%以上。常见的金属离子,如K+、Na+、Ni2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+、Mg2+,对β-葡萄糖苷酶的活性均无明显的抑制作用。乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇、Tritonx-100对β-葡萄糖苷酶的活性有明显的促进作用,而十二烷基磺酸钠对该酶有强抑制作用。葡萄糖对β-葡萄糖苷酶的活性具有抑制作用,其抑制作用高于甘露糖,而半乳糖对该酶的活性无明显影响。在研究底物浓度对酶反应速率的影响时,茶树菇β-葡萄糖苷酶对底物对硝基苯-β-D-葡萄糖苷的米氏常数Km为0.114mM,最大反应速率Vmax为10.96μmol·L-1·min-1。  以乙醇浸提喜树碱后的喜树果渣为原料,利用茶树菇β-葡萄糖苷酶和纤维素酶协同糖化48h后,和纤维素酶单独处理相比,还原糖和葡萄糖的生成量有显著增加,其研究结果为中药残渣的资源化利用提供了基础。  以纳米SiO2颗粒为载体,通过共价固定的方式制备了固定化β-葡萄糖苷酶。研究表明纳米SiO2的饱和负载量为0.058U/mg载体,固定化收率为58.5%。和游离酶相比,固定化酶不仅保留了酶的催化效率,而且比游离酶更稳定。利用固定化酶水解栀子苷制备京尼平时,栀子苷的水解率高达94%。固定化酶重复使用10次后,残留酶活仍为55.8%。
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