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问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans,简称问号钩体)是钩端螺旋体病的病原菌。CO2对于问号钩体的生长是必需的。我们发现1％的CO2可以显著提高问号钩体赖株的生长速度。同位素掺入实验进一步证明,问号钩体能吸收CO2,速率为3080dpm/h·mg干重。
自养微生物吸收CO2的途径主要有五条:还原戊糖磷酸途径、还原柠檬酸途径、还原乙酰辅酶A途径、3-羟基丙酸途径、3-羟基丙酸/4-羟基丁酸途径。问号钩体吸收CO2采用哪条途径,目前未见到相关报道。在问号钩体基因组中,我们找不到编码还原戊糖磷酸途径、还原柠檬酸途径、还原乙酰辅酶A途径的关键酶的基因,但基因组注释预测问号钩体中可能存在部分3-羟基丙酸途径(3-hydroxypropionate pathway),用于同化CO2。
3-羟基丙酸途径中用于固定CO2的两个酶是乙酰辅酶A羧化酶和丙酰辅酶A羧化酶,分别催化第一步和第七步反应。我们在问号钩体基因组中找到了催化从乙酰辅酶A到琥珀酰辅酶A这部分途径的9个酶(第一步到第九步反应)的相关基因。根据已有的问号钩体基因芯片、蛋白质质谱数据分析,证明这9个酶的相关基因在体内都表达,并且体内体外实验都检测到了乙酰辅酶A羧化酶和丙酰辅酶A羧化酶的活力,这表明问号钩体中很可能存在这部分3-羟基丙酸途径。
除了以上部分3-羟基丙酸途径中的乙酰辅酶A羧化酶和丙酰辅酶A羧化酶外,我们在问号钩体基因组中,还找到了编码另外两个用于同化CO2的酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和苹果酸酶)的基因。对问号钩体基因芯片和蛋白质质谱的数据分析表明编码这两个酶的基因都是表达的,反映了问号钩体固定CO2的方式可能不止一种。对体内乙酰辅酶A羧化酶、丙酰辅酶A羧化酶、磷酸烯醇式丙酬酸羧激酶和苹果酸酶比活的测定,则从一定程度上反映了这几种方式对问号钩体同化CO2的相对贡献。
通过测定乙酰辅酶A羧化酶和丙酰辅酶A羧化酶及其突变体的动力学,我们发现:
(1)编码乙酰辅酶A羧化酶和丙酰辅酶A羧化酶的基因是:accC1、accB,accC2、pccB1、pccB2,其中accC1-pccB1和accB-accC2分别构成两个操纵子,pccB2单独转录。
(2)基因accC1和pccB1编码的蛋白:accC1(102kD,α亚基)和pccB1(60kD,β亚基)构成一个丙酰辅酶A羧化酶全嗨(C181-PCCase)。它是一个多功能酶,既能羧化丙酰辅酶A,又能羧化乙酰辅酶A,但对前者的活力明显高于后者。这个酶的最适pH值是8.0,最适反应温度是30℃。该酶对底物丙酰辅酶A的Km值是109.83±13.18μM,Kcat是2.86±0.05S-1；对底物乙酰辅酶A的Km值是4594±491±M,Kcat是0.66±0.03S-1。非变性电泳发现C181-PCCase的分子量略低于669kD,表明全酶结构组成为α4β4。
(3)基因accB,accC2、pccB2编码的蛋白:PccB2(59kD)、AccB(19kD)和AccC2(54kD)构成另一个酰基辅酶A羧化酶全酶(B2BC2-ACCase/PCCase)。它也是一个多功能酶,既能羧化乙酰辅酶A,又能羧化丙酰辅酶A,对前者的活力略高于后者。该酶的最适pH值是7.0(ACCase)和8.0(PCCase),最适反应温度是42℃。
(4)对C181-PCCase的羧基转移酶亚基PccB1的结构模拟和定点突变发现,位于底物结合口袋末端的A431对于底物丙酰辅酶A的特异性非常重要。突变为异亮氨酸可能导致底物结合口袋发生改变,并影响位于A431附近催化位点的相互作用,从而导致该酶对底物丙酰辅酶A的活力降低。