基于高通量测序解析细胞氧化还原状态参与小桐子干旱胁迫响应与适应的调控

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小桐子是具有巨大开发潜力的能源植物树种,而干旱是限制小桐子产业发展的重要环境因素。小桐子经受干旱胁迫时,体内活性氧含量增多,而抗氧化系统活性下降,导致氧化还原状态失衡。因此,弄清小桐子氧化还原状态的调节机制,对理解小桐子如何适应干旱胁迫具有较大帮助。本研究前期通过Illumina Hiseq 2000高通量测序,对小桐子幼苗叶片在干旱锻炼与胁迫过程中的转录组表达变化数据进行分析,现在的研究进一步挑选出调控氧化还原状态的差异表达基因进行显著富集分析并构建通路,测定小桐子幼苗叶片抗坏血酸和谷胱甘肽含量及对关键酶基因进行定量表达分析,以试图解析细胞氧化还原状态如何来调控小桐子幼苗对干旱胁迫的响应和适应。主要研究结果如下:1.以生长三周的小桐子幼苗为实验材料,用10%的PEG6000进行干旱锻炼处理2天,随后进行干旱胁迫3天,将真叶材料均匀混样后进行RNA-seq测序,并以未经处理的小桐子幼苗为对照。测序结果表明,与氧化还原状态调节的关键物质谷胱甘肽代谢相关的基因注释到73条;与抗坏血酸代谢相关基因注释到44条;硫氧还蛋白相关基因注释到39条;谷氧还蛋白相关基因注释到33条。这些基因在干旱胁迫与干旱锻炼过程中,都有不同程度的表达差异变化。抗坏血酸、谷胱甘肽、硫氧还蛋白和谷氧还蛋白作为植物氧化还原状态调节的重要物质和重要蛋白,它们的相关基因表达的改变,表明小桐子的氧化还原状态参与了植物对干旱锻炼和胁迫的响应应与适应过程。2.通过对干旱锻炼及随后的干旱胁迫下小桐子抗坏血酸与谷胱甘肽含量的测定以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性的测定发现,在干旱胁迫的过程中,经过干旱锻炼的小桐子幼苗的谷胱甘肽和抗坏血酸的总含量高于未经过干旱锻炼的小桐子幼苗的总含量。GPX酶活的测定结果表明,在干旱胁迫过程中GPX的酶活性呈升高趋势,经过干旱锻炼后的小桐子幼苗在随后的干旱胁迫初期酶活性相对较低,后期迅速增加,从而比未锻炼幼苗表现出更强的调节能力。其中谷胱甘肽过氧化物酶基因(XM012231531.2)和抗坏血酸过氧化物酶基因(XM012226880.2)在叶片中的本底表达量相对最高且变化倍数显著,在此基础上进行了这两个基因的克隆与功能分析。以试图从生理和分子水平上验证谷胱甘肽和抗坏血酸在小桐子幼苗对干旱胁迫响应和适应过程中起到重要的调节作用。3.对数字表达谱中的谷氧还蛋白(GRX)和硫氧还蛋白(TRX)的相关基因进行聚类分析表明,在干旱锻炼期间相关基因整体变化不显著,而在随后的干旱胁迫过程中变化显著。进一步对谷氧还蛋白家族和硫氧还蛋白家族基因荧光定量结果分析可知,GRX经过锻炼的基因表达量要显著高于未经干旱锻炼的表达量,而硫氧还蛋白家族基因在经过锻炼后上调表达趋势明显增强。此外选取谷氧还蛋白C9这一高表达量的蛋白基因进行分析,发现该基因所编码的蛋白质具有高等植物所特有的典型“CCXX”基序,全长为726bp,编码区为438bp,编码145个氨基酸,与蓖麻、橡胶树和木薯等进化亲缘关系较近。该基因明显受干旱胁迫诱导表达,表明其属于干旱响应基因。综上所述,对调控小桐子氧化还原状态物质、相应关键酶的酶活和基因表达的分析结果表明,干旱锻炼使细胞氧化还原状态调节活性增强,清除活性氧能力增强,进而提高了小桐子的抗旱性。这些研究成果具有一定的科学研究意义和应用前景,并可为其它农作物和林木的遗传改良提供抗旱基因资源。
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