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目的:胶质瘤发病机制和有效治疗方法的研究是神经外科最重要,最热点的研究课题之一。近年研究发现,调控发育相关的信号通路与脑肿瘤的生长密切相关。为了调节在脑肿瘤中异常表达的发育相关信号分子,抑制肿瘤生长,同时最大限度地降低对中枢神经系统的损害,有必要对发育相关的信号通路进行更全面、更深入的研究。Wnt信号通路在不同种属的发育、细胞分化与增殖中起重要作用,而且发现它参与某些肿瘤的形成。Wnt/β-catenin信号通路被认为是经典的Wnt信号通路,异常Wnt信号通路致癌的关键是胞内游离的β-catenin蛋白积累并进入细胞核。β-catenin蛋白的聚集表达与肿瘤的侵袭、转移和预后都有密切的关系。因此有学者认为针对Wnt信号通路的靶向治疗可以抑制肿瘤的形成和生长。我们课题组前期收集94例不同级别的胶质瘤标本和6例内减压切除的正常脑组织用免疫组化的方法研究,发现β-catenin基因在胶质瘤中的表达比正常脑组织明显增高,并且与胶质瘤的级别呈正相关。因此我们认为,β-catenin是一个比较理想胶质瘤分子生物学标记和基因治疗靶点。本研究运用RNA干涉技术构建靶向β-catenin基因的RNA干涉质粒,转染人胶质瘤细胞U251,对该基因在胶质瘤细胞的增殖过程中的影响进行深入研究,以期为胶质瘤的诊断与治疗提供实验依据和靶向治疗途径。方法:根据siRNA设计原则,通过软件设计与参考相关文献,选取含有19个核苷酸靶序列的一条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,形成shRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo载体中,获得靶向抑制β-catenin基因表达的干涉质粒。经酶切、测序鉴定。用脂质体介导该干涉质粒转染U251细胞,通过逆转录PCR、Western blotting方法检测β-catenin基因的mRNA、蛋白水平的表达情况,评价RNA干涉的效果。观察转染后细胞形态的变化,应用MTT法、流式细胞术初步评价转染后对U251细胞生物学效应的影响。结果:成功构建针对靶向β-catenin基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin RNA干涉质粒,经酶切、测序鉴定为目的质粒。转染U251细胞后β-catenin干涉质粒有效降低了胶质瘤细胞中β-catenin基因的mRNA、蛋白的表达水平。通过观察细胞形态发现,48小时以后胞核内出现一些空泡,随时间增加细胞增殖变缓,死亡细胞逐渐增多,出现破碎、崩解等表现,漂浮细胞及细胞周围碎片增多,呈明显的时间依赖性。MTT法研究显示,转染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin质粒的U251细胞24小时、48小时和72小时后,与空白对照组和阴性对照组相比明显受到抑制(P<0.01)。转染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin质粒组U251细胞的增殖随着作用时间的延长,抑制率逐渐升高,且在作用72小时时抑制率较高;空白对照组和阴性质粒转染组比较无统计学差异。流式细胞术检测(FCM)细胞凋亡显示转染pGFP/Neo-shRNA-β-catenin质粒72小时后U251细胞的凋亡率与空白对照组和阴性质粒对照组比较明显增高,具有统计学意义(P<0.01)。FCM检测细胞周期显示转染72小时后,转染β-catenin干涉质粒组与空白对照组细胞周期变化差异有统计学意义(P<0.05),细胞大多聚集在G0/G1期,而S期、G2/M期细胞数目显著下降,处于DNA复制和活动的细胞数目减少,U251细胞增殖受到抑制。结论:靶向β-catenin基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin RNA干涉质粒构建成功,并可特异性沉默β-catenin基因的表达,初步证明转染β-catenin干涉质粒促进了细胞凋亡,抑制细胞的分化和增殖。胶质瘤恶性生长过程与Wnt信号通路β-catenin的激活密切相关。β-catenin是一个比较理想的胶质瘤分子生物学标记和基因治疗靶点。本实验也为深入研究β-catenin介导的Wnt信号通路在胶质瘤发病机制提供实验基础。