论文部分内容阅读
受体相互作用蛋白激酶1（RIP1）是调控肿瘤坏死因子TNFα诱导的炎症反应，细胞凋亡和细胞坏死的重要因子。TNFα结合TNFR1后，介导了三条信号通路，NF-κB信号通路的激活，细胞凋亡和细胞坏死。RIP1的泛素化修饰对TNFα信号通路中RIP1的激活起了重要的调控作用。 赖氨酸(Lysine，K)是泛素化修饰发生的主要位点，因此本研究对已报道的RIP1上可能发生泛素化修饰的赖氨酸突变成精氨酸(Arginine，R)，以期发现肿瘤坏死因子(TNFα)信号通路中，调控RIP1功能的关键位点。我们构建了8个RIP1的突变体，包括K115R，K306R，K316R，K377R，K599R，K604R，K627R和K648R，之前已有报道K377位点的K63多聚泛素化修饰介导了TNFα诱导的NF-κB的激活，因此我们将其作为阳性对照。我们在Jurkat RIP1缺失的细胞中，采用了可诱导表达的逆转录病毒体系，分别构建了以上8个RIP1突变型和回补RIP1野生型的稳定表达细胞株。我们考察了这8个赖氨酸突变RIP1对TNFα，TNFα/Smac，TNFα/Smac/Z-VAD，TNFα/5Z7, TNFα/5Z7/Z-VAD, TNFα/Cycloheximide和TNFα/Cycloheximide/Z-VAD这几种TNFα诱导的细胞死亡模型的影响。 我们的研究表明，RIP1 K627R突变抑制了多种TNFα诱导的细胞死亡模型诱导的细胞凋亡和细胞程序性坏死。而且在MEFs细胞中，与K627R同源的K612R，也有相同的抑制作用。 为了检测RIP1 K627/K612是否参与调控RIP1的泛素化修饰，我们在293T细胞中高表达了RIP1 WT和RIP1 K627R/K612R质粒，质谱的方法分析发现RIP1K627/K612可以发生泛素化修饰，RIP1 K627R/K612R突变抑制了RIP1的K48和K63多聚泛素化修饰，抑制了RIP1二聚体的形成。我们还发现，在Jurkat和MEFs细胞中，RIP1 K627R/K612R突变能够抑制TNFα诱导的ComplexⅠ中RIP1的泛素化修饰和RIP1到TNFR1的招募，抑制凋亡复合体ComplexⅡa（FADD/Caspase-8/RIP1）的形成，坏死复合体ComplexⅡb(RIP1/RIP3/MLKL)的形成以及ComplexⅡ中RIP1的泛素化修饰，但是并没有明显影响TNFα诱导NF-κB信号通路的激活。因此，我们认为在RIP1介导TNFα诱导的细胞凋亡和坏死过程中，人源的K627和鼠源的K612是调控RIP1泛素化修饰的重要的赖氨酸位点。 为了探讨内源性K627/K612对RIP1泛素化修饰和细胞死亡的影响，我们采用Crispr-Cas9的技术得到了RIP1 K612R突变的小鼠。在分离的原代骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)和腹腔巨噬细胞(PM)中，RIP1 K612R突变可以抑制多种TNFα诱导的细胞死亡模型诱导的RIP1激酶依赖性的细胞死亡。在原代MEFs细胞中，RIP1K612R突变抑制了TNFα诱导的ComplexⅠ中RIP1的招募和泛素化修饰以及TNFα/5Z7（TAK1激酶抑制剂）诱导的RIP1的激酶依赖性的细胞死亡。因此，我们认为小鼠内源RIP1的K612也参与调控了TNFα信号通路中RIP1的功能。