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目的:(1)寻找预处理样品的合适的物理方法,使鼠疫F1抗原从细菌荚膜上脱落下来以增加抗原抗体的反应。(2)比较不同化学试剂对样品预处理的效果,筛选出其中有效一种或几种方法。(3)对其中最有效的方法的影响因素进行分析。(4)通过对多项的研究结果的分析,从而确定提高诊断鼠疫抗原胶体金标敏感性的方法。
方法:(1)用分光光度计测定鼠疫菌浓度,建立标准的浓度曲线,得出直线回归方程。(2)用反复冻融的方法处理鼠疫菌,用胶体金免疫层析试纸条(F I—RGICA)测定最小检出量和反应时间。(3)微波照射处理16例样品(A组),并设立对照组(B组),比较最小检菌量和反应时间,并用t检验进行分析。(4)用超声波对鼠疫菌进行预处理,胶体金标测最小检出量。(5)对不同化学试剂:温和剂、变性剂、螯合剂、表面活性剂处理鼠疫菌液效果进行比较。(6)比较不同虹吸角度对金标检测的影响,并用方差分析其统计学结果。(7)观察不同离子强度对胶体金的影响。
结果:(1)分光光度计建立的标准浓度曲线:方程A=0.297×1gx—2.220,7亿/ml鼠疫菌的光密度A值约为0.42。(2)—70℃~20℃反复冻融,随着冻融次数的增加,胶体金标最小检出量逐步上升,由5万/ml鼠疫菌上升到1000万/ml。(3)用微波照射样品组(A组)和对照组(B组),两组最小检菌量没有区别,反应时间经t检验,没有统计学差异。(4)用超声波对鼠疫菌进行预处理,胶体金标检测结果稳定在1万菌/ml。(5)对不同化学试剂预处理鼠疫菌液发现,表面活性剂作用明显优于温和剂、变性剂和鳌合剂,其中尤以非离子型化学剂NP40效果最佳,分别建立直线回归方程,NP40组斜率K为最大。(6)用NP40预处理鼠疫菌液,观察到0.5%~2.0%范围的NP40,pH7.0左右,预处理15分钟以上,能使鼠疫F1抗原溶解释放,最小检菌量稳定在5000菌/ml。(7)用NP40分别组合其它化学试剂预处理鼠疫菌液后,其最小检菌量与NP40组没有明显差别。(8)改变虹吸角度可使金颗粒均匀释放,并增加检测反应线的显色。(9)溶液离子强度的改变可影响显色结果,过高的离子强度可增加非特异性显色。
结论:通过预处理鼠疫菌样本液,能够提高胶体金标检测的敏感性,尤以非离子型表面活性剂为最佳;同时改变一些参数条件亦有利于胶体金显色的稳定判读。