随着人口老龄化的进展,缺血性脑血管病已成为严重危害人类健康的疾病之一,但在治疗上除超早期溶栓及卒中单元外,尚缺乏有效的手段。为实现脑梗死治疗上的突破,研究者对众多临床试验失败的原因进行分析,认为可能与脑梗死复杂的病理变化及治疗药物的作用靶点单一有关,并提出“神经血管单元”的概念。即脑梗死发生后胶质细胞功能的紊乱、微血管结构的破坏均会加重神经元的损伤,仅针对其中的某个环节进行治疗可能收效甚微；因此,寻找与研究新的、多靶点的治疗药物意义重大。在脑外伤及周围神经损伤上的研究发现,黄体酮具有抑制氧自由基、兴奋性氨基酸释放及促进轴突生长、髓鞘形成的作用；提示黄体酮能够通过多种途径发挥神经保护作用。脑梗死与脑外伤具有相似的病理变化,为实现脑梗死治疗上的突破,已有研究观察了黄体酮对脑梗死的治疗价值,研究发现其可以明显改善脑梗死大鼠的神经功能,但是机制不清。因过度活化的小胶质细胞与氧自由基、兴奋性氨基酸、炎症因子等的释放均有关系,且另有研究表明自体神经干细胞的动员亦有助于神经功能的恢复。为进一步研究黄体酮对脑梗死的治疗价值,本研究拟首先研究黄体酮对小胶质细胞活化及相关炎症反应的影响,然后进一步评价黄体酮对自体神经干细胞动员、血脑屏障结构、脑梗死体积及神经功能的影响；研究内容主要涉及到小胶质细胞、血脑屏障的紧密连接、神经元等。第一部分体外研究黄体酮对小胶质细胞活化及相关炎症反应的影响目的：体外研究黄体酮对小胶质细胞活化及与之相关炎症反应的抑制作用,以探讨黄体酮神经保护作用的可能机制。方法：采用改良的McCarthy混合胶质细胞培养法从新生Sprague-Dawley (SD)大鼠(出生24 h内)皮层组织内分离、培养出小胶质细胞。经纯度鉴定后,取培养第一代细胞,用脂多糖(LPS)诱导其活化,并用黄体酮进行干预。采集培养上清液,用ELISA技术检测其内TNF-α、IL-1β的含量；并用MTT法检测LPS刺激及黄体酮干预对小胶质细胞活力的影响。结果：经CD11b/c鉴定,该方法分离的小胶质细胞纯度≥95%。ELISA法检测培养上清液内TNF-α、IL-1β的结果表明,LPS刺激显著增加了小胶质细胞上清液内TNF-α、IL-1β的含量,经黄体酮干预后培养上清液内TNF-α、IL-1β的含量明显下降(均有P<0.05)。MTT分析结果显示,在与对照组比较的基础上,LPS刺激及黄体酮干预对小胶质细胞的活力影响不大(P>0.05)。结论：用LPS刺激小胶质细胞活化能够很好地模拟脑缺血缺氧后的炎症变化。而黄体酮能够有效抑制与LPS刺激有关的炎症反应,说明抑制与小胶质细胞活化相关的炎症反应可能是其发挥脑保护作用的机制之一。第二部分黄体酮对脑梗死大鼠小胶质细胞活化及血脑屏障结构的影响目的：体内研究黄体酮对小胶质细胞活化及相关炎症反应的影响,并探讨其对神经血管单元保护作用的可能机制。方法：成年雄性SD大鼠120只,体重为250-300g。按随机化原则将所用实验动物分对照组(Control),模型组(Ischemia),溶剂治疗组(Vehicle),黄体酮治疗组(PROG)。通过线栓法制作脑梗死(MCAO)动物模型。将黄体酮溶于25% 2-羟丙基-β-环糊精(HBC)内,分别于成模后1h、6h腹腔注射黄体酮,随后每天行皮下注射,以利于逐渐吸收,每次注射剂量为15mg/Kg体质量。分别于成模后24h、72h通过免疫组织化学、Western blot技术检测离子钙接头蛋白(Ionized Calcium-Binding Adapter Molecule 1, Ibal)的表达情况,以反映脑梗死后小胶质细胞的活化情况；并通过上述技术检测与之有关的炎症因子TNF-α、IL-1β、MMP-9及血脑屏障结构蛋白Claudin5的表达情况,最后通过干湿重法检测脑组织含水量。结果：免疫组化染色表明脑梗死大鼠皮层脑组织内均有Iba1、TNF-α、IL-1β、MMP-9与Claudin5的表达；Western blot定量检测结果表明,脑梗死发生后Ibal、TNF-α、IL-1β、MMP-9的表达水平明显升高(P<0.05),血脑屏障结构蛋白Claudin5的表达水平明显下降(P<0.05)。而黄体酮治疗24h或72h后,Ibal、TNF-α、IL-1β、MMP-9蛋白的表达水平均明显下降(P<0.01)。黄体酮治疗24h对皮层脑组织内Claudin5蛋白表达及脑组织含水量的影响较小(P>0.05),在72h时可以显著减轻Claudin5蛋白的丢失程度并抑制脑水肿的严重程度(P<0.01)。结论：脑梗死发生后,通过检测Ibal的表达可以较好地反映小胶质细胞的活化情况,与小胶质细胞活化相关的炎症反应可能与神经血管单元完整性的破坏有关；经黄体酮治疗后小胶质细胞的活化程度及神经血管单元核心结构(血脑屏障)的破坏程度均明显减轻。说明抑制小胶质细胞活化及与之相关的炎症反应可能是黄体酮神经保护作用的机制之一。第三部分黄体酮对脑梗死大鼠脑部BDNF表达及自体神经干细胞增殖的影响目的：研究黄体酮的神经营养作用,进一步探讨黄体酮对神经血管单元保护作用的可能机制。方法：成年雄性SD大鼠84只,体重为250-300g。实验动物分组及给药方法同第二部分。线栓法制作脑梗死动物模型,分别于脑梗死后24h、72h通过免疫组化染色、实时荧光定量PCR、Western blot技术检测脑部脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表达情况；并通过BrdU/Nestin免疫荧光双染技术检测脑梗死7d时室管膜下区神经干细胞的增殖情况。结果：脑梗死发生后,脑部BDNF的表达在基因及蛋白水平均轻度增高；经黄体酮治疗24h、72h后,其表达水平明显增高,与模型组及溶剂治疗组比较,差异有显著性(P<0.01)。治疗7d后,黄体酮亦促进了室管膜下区神经干细胞的增殖,与模型组以及溶剂治疗组比较,差异亦有统计学意义(P<0.01)结论：黄体酮可以在基因及蛋白水平促进脑梗死大鼠脑部BDNF的表达及自体神经干细胞的动员。黄体酮的神经营养作用可能亦为其神经保护作用的机制之一。第四部分黄体酮对脑梗死大鼠脑梗死体积及神经功能的影响目的：研究黄体酮治疗对脑梗死体积及行为学的影响,评价其对脑梗死大鼠的治疗价值。方法：成年雄性SD大鼠24只,体重为250-300g。实验动物分组及给药方法同第二部分。分别于脑梗死后1d、2d、3d用Zea-Longer评分评价大鼠神经功能的缺损程度,并通过TTC染色于脑梗死后3d时检测脑梗死体积。结果：Zea-Longer评分显示,造模前所有大鼠均没有神经功能缺损症状,评分为0。成模后,除假手术组外,其余大鼠均有不同程度的神经功能缺损；经黄体酮治疗后,其神经功能明显改善,与模型组及溶剂治疗组比较差异均有显著性(P<0.01)。TTC染色表明,脑梗死体积在模型组及溶剂治疗组均比较大,且差异无统计学意义；经黄体酮治疗后脑梗死体积明显缩小,较模型组及溶剂治疗组差异均有显著性(P<0.01)结论：黄体酮治疗可以显著减小脑梗死体积,这可能与其促进脑梗死大鼠神经功能的恢复有关。