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研究背景：急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是由多种肺内外致病因素导致的一种危重病症，其基本特征为肺内微血栓形成和大量炎性细胞浸润，其发病机制尚未完全明确，故目前尚无有效的治疗手段，其病死率高达40％。Lima等的研究证实氧化应激在肺损伤模型的结构、功能和炎症反应中都扮演了很重要的角色，这提示如果纠正氧化应激失衡就有可能减轻急性肺损的程度，为急性肺损伤的治疗提供新的方向与方法。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具备自我复制(self-renewal)和多向分化潜能的成体干细胞，最初在骨髓中发现，而后在脂肪、肌肉等组织中都发现了这种特殊的细胞。因其特殊的生物学特性，间充质干细胞现己经逐渐成为组织工程和临床再生医学的重要种子细胞。当前，间充质干细胞的主要来源仍然是骨髓。但由于它的获取途径为有创操作过程，且骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcell,BMMSC）的数量和活性都随着供者年龄的增长而显著降低，且存在染毒风险。以上的缺点，大大制约了间充质干细胞在组织工程和临床再生医学中的应用。目前，已有大量研究证实，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUMSCs)来源广泛，无伦理学制约，且较骨髓来源的间充质干细胞更易体外扩增，并具有更低的免疫原性，因而己经越来越受到人们的重视，逐渐成为组织工程和再生医学中最具发展前景的种子细胞。HUMSCs的发现与成功分离有可能为急性肺损伤的治疗带来新的曙光。之前已有大量研究证明间充质干细胞移植后不仅具有分化能力,还具有免疫调节等功能,但是国内外罕有HUMSCs是否对急性肺损伤氧化应激存在影响的相关报道。目的:人脐带间充质干细胞的分离，培养和鉴定，并探讨其移植对脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤氧化应激的可能影响。方法：1、人脐带间充质干细胞的分离与培养无菌条件下取足月剖宫产产妇的脐带，用PBS冲净残留的血液，用眼科剪剪成肉糜状，先加入胶原酶Ⅱ37℃混匀消化30min，再加入胰酶37℃混匀消化30min，加入10%体积的胎牛血清终止消化，消化后的混合液用100目滤网过滤，除去未消化的组织，收集消化滤液，离心后收集细胞，加入含10%胎牛血清并已加入青/链霉素的DMEM/F12的完全培养基重悬细胞，接种到细胞培养瓶中，置于培养箱中培养。待细胞生长到80%融合时，进行消化传代和扩增培养。在倒置显微镜下观察细胞形态学改变并拍照记录。2、人脐带间充质干细胞表面标志鉴定用流式细胞仪检测人脐带来源间充质干细胞CD29、CD34、CD44、CD105的表达情况。3、人脐带间充质干细胞多向分化能力鉴定油红O染色法和茜素红染色法分别鉴定HUMSCs向脂肪细胞和成骨细胞的分化能力。4、观察人脐带间充质干细胞移植对脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠肺组织病理学的影响自各组大鼠左肺下叶取一小块肺组织，用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色。光镜下观察肺组织形态、结构变化，并拍照。5、测定人脐带间充质干细胞移植对脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠肺组织湿干重的影响自各组大鼠右肺下叶取一小块肺组织，称量湿重，然后置于恒温烤箱烤至恒重，称量干重，计算肺湿/干重比=湿重/干重。6、探讨人脐带间充质干细胞移植对脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤氧化应激的影响将30只Wistar大鼠随机分为生理盐水(NS)对照组(A组)、LPS模型组(B组)和HUMSCs移植组(C组)，每组10只。移植6h后，处死各组大鼠，取肺组织行病理学观察，肺湿/干重比测定，丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性检测。结果：1、组织碎块消化第3天起，可见少量贴壁细胞，形态较小，细胞核不明显，其余大部分未消化的组织碎块悬浮于细胞培养基表面。随着培养时间的延长，贴壁细胞逐渐增多。约7天后，有部分贴壁细胞呈长梭形或扁平形，约10天后，可见大量细胞贴壁，形态为典型的梭状成纤维样细胞，漩涡状生长，2周左右时细胞融合可达80%。经传代培养，可得到较纯化的HUMSCs，细胞形态无明显差异，性质稳定，至少能传代30代以上。2、流式细胞仪鉴定纺锤样细胞高表达CD29、CD44和CD105，几乎不表达造血系标志CD34，符合HUMSCs的表面标志特征。3、HUMSCs经特定培养基诱导后能分化为脂肪细胞或成骨细胞。经油红O染色后细胞核呈蓝色，脂滴呈红色。对照组未见含红色脂滴的细胞。经茜素红染色后细胞之间有大量的红色钙结晶析出，钙结节呈圆形或多边形，折光性强，对照组细胞排列紧密，未见钙结节形成。4、早期移植HUMSCs能明显减轻ALI时炎性细胞浸润程度和肺组织的损伤程度。对照组肺组织结构正常，肺泡结构完整光滑。LPS模型组肺组织水肿，少量出血，光镜下观察可见大量炎性细胞浸润，肺泡壁破坏，肺泡间隔增厚，上述病理形态改变符合ALI的表现。HUMSCs移植组炎性细胞浸润明显减少，肺损伤程度较模型组显著减轻。5、早期移植HUMSCs能减轻急性肺损伤时肺组织的水肿程度。与对照组比较，模型组肺W/D比明显增加(P<0.05)。与模型组比较，HUMSCs移植组肺W/D比明显降低(P<0.05)，差异有统计学意义。6、早期移植HUMSCs能减少ALI时肺组织内MDA的含量，并提高肺组织内SOD的活性。与对照组比较，模型组肺组织MDA含量明显升高(P<0.05)；与模型组相比，HUMSCs移植组MDA含量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义；与对照相比，模型组SOD活性明显降低(P<0.05)；与模型组相比，HUMSCs移植组SOD活性明显升高(P<0.05)，差异有统计学意义。结论：本实验结果显示，B组在注射LPS后6h产生了明显的肺部损伤，同时机体抗氧化应激能力显著下降。B组肺组织中MDA含量显著高于A组，肺组织内SOD活性显著低于A组。说明LPS所致的肺损伤使肺部发生了强烈的氧化应激。这不仅可直接损伤肺泡上皮细胞及肺泡毛细血管内皮细胞，还可通过肺部脂质过氧化反应继续产生大量氧自由基，并以多种途径造成肺泡毛细血管内皮细胞的损伤。正常状态下，机体抗氧化系统可以清除过量的氧自由基，使机体不会被氧自由基损伤。而注射LPS后，肺部发生了强烈的氧化应激，机体抗氧化应激能力不足，导致了严重的肺损伤。早期移植HUMSCs能显著减轻LPS诱导的大鼠ALI时炎性细胞的浸润及肺组织水肿程度，并一定程度上纠正氧化应激的失衡。但此效应究竟是通过HUMSCs的定向分化能力还是旁分泌作用来实现的，还有待研究的进一步证实。