铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)为革兰氏阴性杆菌,是目前临床上造成医院内感染的最重要的机会致病菌之一。该菌本身对许多抗生素天然不敏感,并且随着抗生素的大量使用,铜绿假单胞菌对原本敏感的抗生素也产生了耐药性。因此,在临床上对铜绿假单胞菌感染的治疗,尤其是对多重耐药菌株感染的治疗成为非常棘手的问题。在此背景下,人们把目光转向了噬菌体的治疗潜力。噬菌体是一类广泛存在于自然界中的可感染细菌的病毒,其数量庞大,约为细菌的10倍(>1031)。据统计,截止到2013年3月,已有921株噬菌体被报道完成全基因组测序。它于1915年由FrederickW.Twort研究发现,而1919年就将其作为抗菌物质进行实验研究。之后对于噬菌体的研究一直在继续,研究者相继鉴定了多种细菌的不同噬菌体,在噬菌体治疗方面也取得了许多显著成绩。然而,噬菌体作为一种抗感染治疗手段迄今没能在临床推广应用。就其原因,最重要的是我们对噬菌体这一生命现象的认识还不够,尤其是对扩展噬菌体宿主谱、提高噬菌体治疗制剂的广谱性方面还缺乏有效突破口。因此,新发现并鉴定不同的噬菌体仍然是非常重要的工作,这将为噬菌体治疗的发展打下必要的基础。　　本文以铜绿假单胞菌的一株临床分离株PA1作为宿主谱,从西南医院的污水中分离到1株噬菌体,命名为PaP4。首先通过最佳感染复数,一步生长曲线和结构蛋白对其生物学特性进行了研究分析;其次提取基因组DNA送至北京华大基因研究中心进行全基因组测序,并通过实验将噬菌体PaP4的全基因组鉴定为环状;进而对基因组进行了初步注释并提交序列到GenBank。最后通过生物信息学比对分析,证实噬菌体PaP4属于LUZ24-like噬菌体家族成员。研究内容及结果主要包括以下几个方面。　　1.宿主菌铜绿假单胞菌PA1的背景。PA1为新桥医院检验科分离的临床分离株,用成都生物制品研究所提供的分群血清鉴定为第11群,本实验室保存并长期对其进行研究,目前已对其完成了全基因组测序(GenBankNo.CP004054)。　　2.以铜绿假单胞菌PA1为宿主菌,采用混合宿主菌扩增噬菌体的方法,从西南医院污水中分离到1株具有透明噬斑的裂解性噬菌体,命名为PaP4。噬菌体基因组经限制性内切酶酶切鉴定为dsDNA。通过终点滴定法可知该噬菌体滴度为8×1010。样品染色后,用电镜观察发现PaP4有一个多面体立体对称的头部,直径约为50nm,并有一个约30nm的短尾,形态学上属于短尾科噬菌体。由感染复数实验得出噬菌体PaP4感染其宿主菌PA1的最佳感染复数是0.001。根据一步生长曲线可知,噬菌体PaP4感染宿主菌的潜伏期约为20min,爆发期约为20min,爆发量约为150。SDS-PAGE蛋白电泳分析发现,在中分子量蛋白质标准范围内,凝胶上至少出现了7条蛋白条带,表明噬菌体PaP4中至少含有7个结构蛋白。　　3.将噬菌体PaP4基因组DNA提取纯化后送至华大基因北京研究中心对其进行全基因组测序。经BLAST比对检索,确定噬菌体PaP4为一株全新噬菌体。同时用全覆盖PCR扩增的方法,确定了其序列的正确性。利用基因组的实际酶切图谱和电子酶切图谱的比较方法,最终将PaP4全基因组鉴定为环状结构。　　4.噬菌体PaP4基因组的一般概况。①基因组测序表明该基因组全长为43,895bp,通过软件分析其碱基组成是:A=24.29％,G=26.44%,C=26.02%,T=23.25%,G+C=52.46%,明显的低于其宿主菌PA1的G+C含量(66.3%)。②噬菌体PaP4的基因组序列中未发现tRNA基因。　　5.基因组的生物信息学分析以及基因功能的探讨。噬菌体PaP4全基因组具有264个大于100bp的ORFs,其中70个预测为编码基因,编码序列总长度为41,525bp,基因的平均DNA长度为627bp。在整个基因组DNA中,平均每1000bp长度中有1.63个推定基因,基因组中碱基的使用率达到94.6%。使用蛋白质序列对蛋白质序列的比对工具,在国际公共数据库中发现了18个同源蛋白质。　　6.通过基因组比对发现,噬菌体PaP4全基因组与LUZ24-like家族噬菌体的基因组相似性非常高(92%~76%)。进而,利用MEGA软件工具对搜索到的具有显著相似性的基因进行多重比对,通过phylip软件绘制系统发生树,用TreeView软件观察结果。并通过CoreGenes的蛋白相关性分析最终证实噬菌体PaP4属于LUZ24-like噬菌体家族的新成员。　　噬菌体PaP4的全基因组序列已经在GenBank登录(No.KC294142)　　综上所述,通过本研究,明确了新分离的一株铜绿假单胞菌噬菌体PaP4的基本生物学特性及其全基因组生物信息学特性,并对该基因组进行了初步注释。PaP4成为继本室分离鉴定的PaP1,PaP2和PaP3之后的第四株铜绿假单胞菌噬菌体。并通过对这4株噬菌体生物学特性及基因组学特性的比较,进一步揭示了噬菌体的生物多样性,为全面深入地认识噬菌体的遗传与变异、进化与分类、基因组织与调控以及寄生机制等生物学特性中的重大问题提供了新的数据。同时,注释结果表明PaP4属于LUZ24-like噬菌体家族新成员,扩展了LUZ24-like噬菌体家族的成员数目。