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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种给全世界的养猪业造成巨大损失的病毒性传染病。研究发现PRRSV通过自身编码的蛋白抑制机体的天然免疫应答,实现免疫逃避,但目前关于PRRSV编码的nsp4蛋白抑制JAK-STAT信号通路的分子机制有待进一步研究。本研究通过研究PRRSV编码的nsp4与JAK-STAT信号通路之间的相互作用,发现nsp4能切割关键信号分子STAT2。进一步分析了nsp4切割STAT2的氨基酸位点,探讨nsp4切割STAT2在PRRSV调控天然免疫反应中的作用。主要内容如下:1.PRRSV感染细胞后抑制ISGs的表达通过相对荧光定量PCR检测发现PRRSV感染PAMs细胞和MARC-145细胞后显著抑制IFN-α诱导的2’,5’-OAS,ISG15,ISG56和ISG60的m RNA水平;双荧光素酶实验结果显示PRRSV感染MARC-145后可以显著抑制IFN-α对ISRE-Luc的激活。为筛选出抑制ISRE活性的蛋白,将PRRSV编码的所有结构蛋白和非结构蛋白的真核表达质粒与荧光素酶报告质粒ISRE-Luc和p GL-4.74共转染HEK-293T细胞,双荧光素酶实验结果显示PRRSV的非结构蛋白nsp1a、nsp1b、nsp4、nsp11、nsp12,结构蛋白GP3和N均能抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活性,其中nsp4抑制效果显著。2.PRRSV编码的nsp4蛋白依赖其丝氨酸蛋白酶活性抑制IFN-α诱导的ISRE活性将真核表达质粒nsp4进行倍比稀释与荧光素酶报告质粒ISRE-Luc共转染HEK-293T或3D4细胞,双荧光素酶检测结果显示在这两种细胞上nsp4均能显著抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活性,并且呈明显的剂量依赖;利用双荧光素酶报告系统证明nsp4抑制IFN-α诱导的ISRE启动子活性依赖其丝氨酸蛋白酶活性。3.PRRSV编码的nsp4蛋白切割STAT2位点为E719本研究发现超表达nsp4对STAT2蛋白的m RNA水平没有影响,而切割JAK-STAT信号通路中关键蛋白STAT2,且呈明显的剂量依赖;本研究证明nsp4切割STAT2不依赖泛素-蛋白酶体途径和细胞凋亡途径,而是依赖于自身的丝氨酸蛋白酶活性,并鉴定出nsp4切割STAT2的位点为E719。PRRSV感染MARC-145细胞后,Western Blot检测发现内源性STAT2被降解,但是检测不到切割条带。4.PRRSV编码的nsp4蛋白拮抗JAK-STAT信号通路本研究将nsp4真核表达质粒与STAT1和STAT2真核表达质粒共转染HEK-293T细胞,通过Co-IP实验发现PRRSV编码的nsp4蛋白切割STAT2之后,STAT1和STAT2的相互作用显著减弱。将STAT2全长或截短突变体与STAT1和IRF9共转染,双荧光素酶实验和荧光定量PCR结果显示只有全长STAT2可以与STAT1和IRF9作用激活ISRE,诱导ISGs表达,截短的STAT2不能激活ISRE活性和ISGs的表达,nsp4切割STAT2抑制了JAK-STAT信号通路的信号传递。综上所述,本研究首次揭示了PRRSV编码的nsp4蛋白在拮抗JAK-STAT信号通路中的重要作用;发现PRRSV编码的nsp4蛋白依赖其自身的丝氨酸蛋白酶活性切割JAK-STAT信号通路中重要信号分子STAT2蛋白,阻止信号向下游传递,抑制ISRE启动子活性,以及ISGs的转录表达。同时鉴定出nsp4切割STAT2的位点是E719。本研究加深了我们对PRRSV致病和免疫逃避机制的理解,为PRRSV疫苗研究与开发提供理论依据。