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抗冻蛋白(AFPs),也称热滞蛋白,具有降低溶液的冰点,抑制重结晶的能力。近些年,抗冻蛋白的研究主要集中在生物体的低温保护方面,且发展较快。由于天然抗冻蛋白纯化困难,成本高,使得其应用受到了限制,通过生物工程的办法获得大量生产抗冻蛋白,显得尤为必要。本文采用分子生物学技术,将新疆荒漠昆虫Blaps kashgarensis抗冻蛋白基因Bkafp972插入含AOX 1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastorris)表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K- Bkafp972,转化大肠杆菌E.coli Top10 F’,序列经分析后,取阳性转化子转化Pichia pastorris GS115,筛选多拷贝整合转化子。在0.5 %甲醇诱导条件下小量摇瓶发酵。Tricine SDS-PAGE、Western blotting和HPLC等技术被用于鉴定目的蛋白的表达,通过低温菌落保护试验,及重组蛋白对溶液冰晶形态修饰的观察检测目的蛋白的生物活性。结果显示,目的基因片断正确的插入穿梭质粒pPIC9K,目的基因没有发生突变,DNA测序结果说明了目的基因插入的正确性,成功的构建了重组表达载体pPIC9K- Bkafp972。Western blotting分析重组蛋白已成功表达,且产物具有良好的抗原性,这与Tricine SDS-PAGE和HPLC的结果相一致。表达粗提产物具有较强的细菌低温保护活性,且具有类似天然抗冻蛋白的溶液冰晶修饰能力。将新疆荒漠昆虫戈壁琵琶甲(Blaps kashgarensis)AFP基因Bkafp972原核表达,制备了特异性的抗血清,测量了原核表达产物的热滞活性。然后使用一种全新的静脉发送方法,将抗冻蛋白应用到生物器官的低温保护研究中。肝脏组织切片的结果表明,这种方法可以有效的保护小鼠肝脏在低温条件下不受冰冻的伤害。