研究背景支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)是极低出生体重早产儿最常见的一种慢性肺疾病。随着围产医学的不断进步,包括产前糖皮质激素和出生后肺表面活性物质的应用以及机械通气的实施,早产儿的存活率不断升高,BPD的发病率不断升高,有很高的长期致残率和致死率,已经成为NICU最难以解决的问题之一。存活者常有慢性肺功能异常及气体交换异常等,需要长期依赖氧气或呼吸机治疗,对家庭和社会带来沉重的经济和精神负担,也直接影响患儿日后的生活质量。因此,研究如何防止或延缓BPD的发生发展,降低BPD的发生率是保护我国有限医疗资源,关乎社会经济发展的重要课题。BPD是一种多因素疾病,其病因及发病机制极其复杂,涉及高氧、机械通气、产前感染和产后炎症反应等多个方面,导致迄今为止尚未有一种有效办法对其进行预防及治疗。目前公认为,氧化应激以及炎症反应在BPD的发病学中起了至关重要的作用。氧化应激主要是活性氧(ROS)的产生和抗氧化酶降解ROS的能力失衡导致的[1]。正常情况下,人体内ROS的产生和保护细胞的抗氧化防御系统之间存在着一种微妙的平衡。当ROS增加或抗氧化防御系统功能不足而不足以清除ROS时,这种平衡将会被打破。长时间的高氧暴露将导致过多ROS的生成,当ROS水平超过细胞的抗氧化能力时,细胞将遭受氧化应激损伤。其中,超氧化物歧化酶(SOD)在清除ROS的过程中发挥了至关重要的作用。其主要的作用是将活性极强的超氧化自由基转化为过氧化氢和水,然后过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、和谷胱甘肽还原酶将过氧化氢转变为水。氧化应激损伤的同时可以引起脂质过氧化作用,形成丙二醛(MDA),而SOD能清除氧自由基保护细胞免受损伤,其活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。炎症反应在BPD的发生发展中起了非常关键的作用。多种细胞因子包括IL-6、IL-8、IL-10、ICAM-1等均参与了肺炎症反应,与BPD的发生密切相关。NF-κB是调控上述多种炎症因子的重要转录因子。其可以上调多种炎症因子的表达,从而诱发炎症的发生、促进BPD的发生发展。NF-κB是P65/P50组成的异源二聚体复合物,通常情况下,与抑制型IκB蛋白结合,存在于细胞的胞浆中,当内皮细胞受损后,NF-κB发生磷酸化并降解,NF-κB活性增加,p65和p50的mRNA转录增加,并发生核转位,其中含有转录活化区域的p65与DNA上特定的KB序列结合后可促进多种炎性细胞因子和黏附分子基因的转录NF-κB激活后,导致炎症相关因子的过度表达,引起明显的炎症反应。同时,炎症介质和细胞因子的产生和释放增多,又进一步激活NF-κB,导致炎症信号不断放大,作用时间延长,进一步加重炎症反应。NF-κB的活化可刺激内皮细胞释放IL-8,IL-8是强效的中性粒细胞趋化因子,可促进并延长炎症反应针对BPD的抗氧化及抗炎药物也成为国内外研究的主要课题。其中研究最多的药物是糖皮质激素,其抗炎抗氧化效应显著,对降低BPD的发生率有非常重要的作用,然而因其可以引起多种严重的不良反应而使其临床应用受到限制。因此,迫切需要寻找一些新的高效、安全的药物改善BPD的治疗现状。我国的天然中药不仅药源丰富,且不良反应轻微,有安全低毒、价廉高效等优点,具有良好的研究开发前景。黄芪多糖是目前临床应用较为广泛、研究比较深入的中药之一,其为黄芪中最重要的天然有效成分之一,因其具有抗氧化、清除自由基、抗炎、提高免疫功能等广泛的生物学活性,近年来越来越受到学者们的重视。其中,黄芪多糖较好的抗氧化及抗炎作用倍受人们的关注。研究发现,在体外实验中,APS通过增加细胞的总抗氧化能力以及减少氧自由基的生成进而减轻大鼠肺上皮细胞损伤。APS还可以保护阻塞性黄疸的大鼠肠粘膜免于氧化应激的损伤,其作用机制与增加超氧化物岐化酶SOD以及减少脂质过氧化产物MDA的含量有关。岳晓莉等研究证实APS具有促进慢性溃疡愈合的作用,其作用机制与降低炎症细胞表达、降低创面脂质过氧化程度、增强抗氧化酶SOD的表达而发挥其抗氧化应激损伤的功效有关。另外,APS还可提高红细胞膜的流动性及超氧化物歧化酶的活性,降低过氧化脂质含量,减轻自由基造成的损伤。研究表明,APS能够抑制再灌注损伤的人心脏微血管内皮细胞中VCAM-1、ICAM-1及NF-κB mRNA的表达,从而减轻内皮细胞的炎症反应及黏附作用。在脂多糖诱导的炎症反应中,APS可以抑制TNF-a和IL-8的产生,可能对阻止炎症的发生发展发挥一定的作用。在骨关节炎中,APS可以减轻滑膜细胞的炎症反应,并能减少凋亡的产生。然而,关于黄芪多糖在BPD中的研究目前国内外罕见报道。APS是否可以通过抗氧化和(或)抗炎作用防止或延缓BPD的发生发生,尚不完全清楚。人脐静脉内皮融合肺腺癌细胞(EA.hy926cell)是永生化的脐静脉内皮细胞系。其结构特点与功能均和肺泡内皮细胞相似,可用于构建肺泡体外模型。EA.hy926细胞已经被广泛应用于白细胞黏附、内皮细胞的氧化应激、蛋白表达调控等多方面的研究中。研究目的1.建立BPD体外细胞模型；2.探讨黄芪多糖通过对EA.hy926细胞抗氧化及抗炎作用有效防治早产儿支气管肺发育不良的发生发展；3.进一步分析黄芪多糖通过NF-KB信号通路发挥抗炎作用,在分子水平上寻找到黄芪多糖的药物作用靶点,为临床上预防及治疗BPD开辟新的治疗途径。研究方法1.实验分组EA.hy926细胞呈贴壁生长,培养于含10%FBS的高糖DMEM培养基中。实验分三组,即空气组,将细胞至于5%CO2.37℃的培养箱中培养24、36、48小时；高氧组,将细胞至于三联混合气中37℃培养24、36、48小时；高氧+APS组,将细胞至于三联混合气中37℃培养24、36、48小时。2.运用化学试剂方法分别检测各组中SOD、MDA、ROS的表达水平。3.运用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real-time PCR)技术和免疫印迹(Western Blotting)法分别检测各组中ICAM-1、IL-8、NF-kB p65mRNA和蛋白的动态表达水平。4.采用SPSS13.0软件进行分析。数据采用X±S表示,各组间均数比较采用析因分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、在24、36两个时间点高氧组SOD水平均低于APS组和空气组,空气组与APS组比较则没有统计学意义(P>0.05)；在48小时时间点高氧组与APS组相比没有统计学意义(P>0.05),而空气组SOD水平则明显高于高氧组和APS组。36小时APS组SOD水平明显高于24小时APS组SOD水平(F=28.845,P<0.01)。2、在24、36两个时间点高氧组MDA水平均明显高于APS组和空气组,空气组与APS组比较则没有统计学意义(P>0.05)；在48小时时间点高氧组与空气组、APS组相比没有统计学意义(P>0.05)。3、在24、36两个时间点高氧组ROS水平均明显高于APS组和空气组,APS组ROS水平明显低于空气组(P<0.01)；在48小时时间点高氧组与APS组相比没有统计学意义(P>0.05),而空气组ROS水平则明显低于高氧组和APS组。48小时APS组ROS水平明显高于24、36小时APS组ROS水平(F=675.247,P<0.01)。4、在24、36、48小时三个时间点高氧组的IL-8基因表达水平均明显高于APS组,24、36小时高氧组的IL-8基因表达水平为APS组的3倍,48小时高氧组的IL-8基因表达水平为APS组的2倍。三个时间点之间各组IL-8基因表达水平无明显差异(F=0.233,P=0.794)。5、在24、36、48小时三个时间点高氧组的ICAM-1基因表达水平均明显高于APS组,在24小时时间点高氧组的ICAM-1基因表达水平为APS组的4倍,在36小时时间点高氧组的ICAM-1基因表达水平为APS组的1.58倍,在48小时时间点高氧组的ICAM-1基因表达水平为APS组的1.63倍,。三个时间点之间各组ICAM-1基因表达水平无明显差异(F=1.947,P=0.159)。6、高氧组各时间点的NF-KB、ICAM-1、IL-8蛋白表达均高于空气组。APS组各时间点NF-KB及ICAM-1、IL-8蛋白表达均明显低于高氧组。结论1.APS可增加EA.hy926细胞内的SOD表达,同时能降低细胞MDA水平,从而清除细胞内氧化应激产生的ROS,达到抗氧化目的,保护细胞免受氧化应激损伤。2.APS可显著减低EA.hy926细胞内ROS的含量,提高抗氧化应激能力。3.APS可下调NF-κBp65、ICAM-1、IL-8的表达,减轻炎症反应,协同抗氧化作用保护细胞。