越来越多的实验结果提示内皮祖细胞(EPCs)通过合成并分泌细胞因子来促进血管新生和内皮层的修复。其中血管内皮生长因子(VEGF)和白介素8(IL-8)在EPCs通过旁分泌因子促进血管新生和内皮修复的作用中扮演着主要的角色。血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平升高作为缺血性心血管病的一个独立危险因素,参与缺血性心血管病发病的多个环节,其机制十分复杂。研究发现,Hcy损害外周血EPCs的数量和功能。相关文献报道Hcy减少EPCs数量并损害其增殖、迁移和黏附功能,且随着Hcy浓度增加及作用时间延长,EPCs的数量减少和功能损害明显加重。随后的在体研究显示高Hcy血症患者外周血EPCs数量减少、功能减退。进一步研究提示Hcy加速EPCs衰老,伴随EPCs增殖和集落形成能力的损害。Hcy加速EPCs衰老可能跟EPCs端粒酶活性下降以及Akt磷酸化水平的下降有关。尽管高Hcy引起EPC增殖、迁移等功能受损,但是,Hcy是否影响EPCs的旁分泌功能目前并不清楚。因此,我们拟进一步观察Hcy对EPCs旁分泌能力以及旁分泌细胞因子在体内皮修复能力的影响。另外值得关注的是,Hcy影响EPCs功能损害的确切机制目前仍有待明确。作为过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)激动剂的一种,匹格列酮(pioglitazone,PIO)已被证明能够调节细胞粘附,迁移以及新生血管能力。研究发现,PIO可以抑制EPCs的凋亡并增加小鼠体内的血管新生。PIO亦可以改善糖尿病和冠心病病人体内的EPCs的迁移和粘附能力。但是PIO对EPCs的治疗作用是否包括改善其旁分泌能力目前还有待进一步证实。因此,基于上述考虑,我们首先观察Hcy对于EPCs旁分泌细胞因子VEGF和IL-8的影响,EPCs旁分泌能力在体内对损伤内皮层的影响；PIO能否改善Hcy环境下EPCs的旁分泌,粘附和迁移能力及机制；PIO对NADPH酶亚基蛋白表达的影响。以下分三部分对本研究的方法、结果及结论作一简述。1同型半胱氨酸对内皮祖细胞旁分泌功能的影响目的：探讨Hcy体外干预EPCs对EPCs旁分泌功能的影响。方法：采用密度梯度离心法从健康人外周血获取单个核细胞,接种于人纤维连接蛋白包被的培养板,培养7d后,采用激光共聚焦显微镜检测FITC-UEA-I及DiI-acLDL双染色鉴定EPCs,采用流式细胞仪检测其表面标志(VEGFR-2,CD34, CD133),进一步鉴定EPCs。采用不含细胞因子的培养基EBM-2替代正常培养基培养EPCs24h,通过real-time PCR法检测EPCs细胞内细胞因子合成的变化,并采用ELISA法检测条件培养基中VEGF和IL-8水平。加入不同浓度的Hcy(10,50,100,200和500μmol/L)干预24h,观察量效关系。此外,采用200μmol/L的Hcy分别干预不同时间(3,6,12,24和36h),观察时效关系。采用球囊损伤法建立大鼠颈动脉损伤模型,雄性Sprague-Dawley大鼠在颈动脉损伤后分别按如下分组进行灌注：(1)正常对照组；(2)颈动脉损伤+单纯培养液；(3)颈动脉损伤+EPCs条件培养液；(4)颈动脉损伤+Hcy干预后EPCs条件培养液。一周后观察不同条件培养液对大鼠颈动脉内皮修复的影响。结果：与正常培养基相比,在不含细胞因子及血清的条件培养基培养环境中,EPCs大量合成VEGF和IL-8,而其他细胞因子如IGF, HGF, SDF-1,PDGF-BB和Tβ4的合成无明显变化。ELISA法检测EPCs条件培养基中VEGF, IL-8浓度分别为260.54±32.09pg/ml/1×106EPCs,15724.54±1817.24pg/ml/1×106EPCs。高浓度Hcy抑制EPCs分泌VEGF和IL-8。200μmol/L浓度Hcy干预EPCs时间依赖性抑制VEGF和IL-8的分泌。EPCs条件培养基显著促进大鼠颈动脉内皮层修复,体外受到Hcy干预的EPCs条件培养基的促内皮修复能力受到抑制。结论：EPCs合成分泌以VEGF和IL-8为主,通过旁分泌细胞因子可促进大鼠动脉内皮修复。Hcy显著减少EPCs旁分泌VEGF和IL-8,并损害EPCs通过旁分泌功能修复损伤动脉的作用。2匹格列酮通过抑制PKC的表达和NADPH酶的活性逆转同型半胱氨酸下调的内皮祖细胞旁分泌,粘附和迁移功能目的：探讨匹格列酮(PIO)对Hcy下调的EPCs旁分泌,粘附和迁移功能的作用以及相关机制。方法：从健康人外周血分离、培养循环EPCs7d。 EPCs条件培养液(EPCs-derived conditioned medium,EPC-CM)是体外培养循环EPCs用不含血清的EBM-2培养24h后获得。如前述,EPCs在Hcy环境下(200μmol/L)培养24h,并提前30min加入PIO(10μmol/L)共处理。采用ELISA和realtime-PCR分别检测VEGF和IL-8在条件培养液中的浓度和细胞内相应mRNA合成水平。Western blot检测Hcy对EPCs中的PKC磷酸化水平的影响,并加入PIO和PKC抑制剂预处理30min,观察PKC磷酸化的变化。细胞内活性氧(ROS)浓度通过在细胞内装载荧光探针H2DCF-DA后用流式细胞仪分析。NADPH酶活性采用以光泽精基础的化学发光检测法。观察预先加入PIO,NADPH抑制剂DPI和PKC抑制剂GF对Hcy诱导的EPCs内ROS和NADPH酶活性的影响。对于GF和DPI预处理的Hcy共培养的EPCs,通过ELISA和realtime-PCR观察抑制PKC和NAPDH酶后对EPCs旁分泌的影响。采用粘附能力测定实验和millicell小室分别观察PIO对Hcy诱导下的EPCs的粘附能力和迁移能力的影响。结果：PIO逆转Hcy下调的VEGF和IL-8的mRNA合成和蛋白分泌水平。Westernblot提示Hcy能时间依赖性激活P-PKC,以PKCβⅡ激活为主,而PIO能抑制PKC的磷酸化。化学发光检测法提示Hcy能时间依赖性激活NADPH酶,PIO, PKC抑制剂GF可以抑制NADPH酶的激活。通过荧光探针检测EPCs内ROS,PIO, NADPH酶和PKC抑制剂减少Hcy上调的活性氧生成。PKC抑制剂和NADPH酶抑制剂逆转Hcy下调的VEGF和IL-8水平。PIO可以改善Hcy诱导的EPCs的粘附迁移能力损伤。结论：PIO能显著改善Hcy对EPCs的旁分泌,粘附和迁移功能的损害。PIO通过抑制PKC的激活和NADPH酶的活性逆转Hcy所诱导的EPCs功能损伤。3匹格列酮对同型半胱氨酸干预下内皮祖细胞NADPH酶的影响目的：探讨PIO对Hcy干预下EPCs的NADPH酶亚单位的影响。方法：从健康人外周血分离、培养循环EPCS。培养第七天,采用不同浓度的Hcy(10,50,100和200μmol/L)干预EPCs24h,Western blot检测NADPH酶亚单位p67和Nox2。分别预先加入PIO (10μmol/L), NADPH酶抑制剂DPI和PKC抑制剂GF共培养,观察PIO对Hcy干预下NADPH酶亚单位表达的影响。采用p67-siRNA和Nox2-siRNA干扰NADPH酶相应亚基蛋白合成,观察亚基蛋白下调后对Hcy诱导的EPC旁分泌功能损伤的作用。采用ELISA和real-time PCR检测VEGF和IL-8表达。采用粘附能力测定实验和millicell小室分别观察下调p67或Nox2亚单位对Hcy诱导下的EPCs的粘附能力和迁移能力的影响。预先加入PPARy受体特异性抑制剂GW9662以观察PIO是否通过该受体来拮抗Hcy的病理作用。结果：Hcy浓度依赖性增强NADPH亚单位p67和Nox2的表达。PIO抑制了Hcy上调的p67和Nox2蛋白的表达。NADPH酶抑制剂DPI和PKC抑制剂GF同样也抑制了NADPH酶亚单位蛋白的上调。p67-siRNA和Nox2-siRNA转染后显著抑制p67和Nox2蛋白表达。单独下调p67亚单位蛋白拮抗Hey诱导的EPCs旁分泌因子减少,单独下调Nox2亚单位蛋白统计学上无明显差异。下调p67或Nox2蛋白表达都可以逆转Hcy诱导的EPCs粘附能力和迁移能力损伤。我们使用了PPARγ抑制剂GW9662并发现其不能抑制匹格列酮带来的有利效应。结论：PIO能显著改善Hcy诱导下EPCs中NADPH酶亚单位蛋白的上调,这种作用通过抑制PKC的激活获得与NADPH酶抑制剂DPI相同的效果。转染p67-siRNA后逆转了Hcy诱导的EPCs旁分泌VEGF和IL-8的减少。单独下调p67或Nox2亚基都可以拮抗Hcy损伤的EPCs粘附和迁移能力。PIO改善EPCs旁分泌功能不依赖于PPARγ受体的激活。